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1材料與方法

1.1空載納米粒子體外溶血試驗(yàn)在紅細(xì)胞懸浮液中加入蒸餾水，由于滲透壓差異導(dǎo)致紅細(xì)胞破裂作為陽性對(duì)照，在紅細(xì)胞懸浮液中加入PBS使得紅細(xì)胞不破裂作為陰性對(duì)照組，選取兩種高濃度（2mg/mL、1mg/mL）的空載納米粒子進(jìn)行了溶血測(cè)試。

1.25-FU-PCL-NP的體外釋藥研究使用分光光度計(jì)對(duì)5-FU溶液進(jìn)行200~400nm的全波長掃描，確定了5-FU在水相環(huán)境下的最大吸收波長為266.4nm，調(diào)整至標(biāo)準(zhǔn)曲線模式，分別選擇最大吸收波長作為光源，進(jìn)行5-FU標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制，通過這條標(biāo)準(zhǔn)曲線，藥物釋放環(huán)境下，分別于0、12、24、36、48、72h測(cè)得吸光度值，并根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算釋藥量，繪制釋藥曲線。

1.3細(xì)胞培養(yǎng)Hccc-9810細(xì)胞在含10%胎牛血清的1640培養(yǎng)基中，37℃，5%CO2飽和度下培養(yǎng)。

1.4CCK-8法測(cè)定腫瘤細(xì)胞增殖抑制實(shí)驗(yàn)取處于對(duì)數(shù)生長期的Hccc-9810細(xì)胞，接種于96孔板，調(diào)節(jié)細(xì)胞濃度，使每孔細(xì)胞數(shù)為8000個(gè)，37℃，5%CO2飽和度下培養(yǎng)箱孵育過夜，待細(xì)胞貼壁后，分按空白NP組，單純5-FU組，5-FU-PCL-NP組（按載藥率折算5-FU的量），分別按5-FU藥物濃度0、5、10、15、20、40、80μg/mL，每個(gè)濃度組設(shè)立5個(gè)復(fù)孔，共培養(yǎng)48h，后均用CCK-8法檢測(cè)各孔存活細(xì)胞吸光度。細(xì)胞存活率=（處理組OD值-空白對(duì)照組OD值）/（對(duì)照組OD值–空白對(duì)照組OD值）×100%。同時(shí)計(jì)算半數(shù)有效濃度（IC50）值。

1.5流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡率取處于對(duì)數(shù)生長期的Hccc-9810細(xì)胞，接種于6孔板，調(diào)節(jié)細(xì)胞濃度，使每孔細(xì)胞數(shù)為2×105個(gè)，將細(xì)胞分為：空白對(duì)照組、空載納米粒組、單純5-FU組、5-FU-PCL-NP組；根據(jù)CCK-8實(shí)驗(yàn)所篩選出半數(shù)有效濃度，按5-FU1.5μg/mL分別加藥共培養(yǎng)細(xì)胞48h，用不含EDTA的胰酶消化收集收集6孔板細(xì)胞，PBS清洗2遍，加入500μL的結(jié)合緩沖液懸浮細(xì)胞，加入分別5μLAnnexinV，5μLPropidiumIodide混勻；避光，室溫下反應(yīng)15min，后上機(jī)檢測(cè)細(xì)胞凋亡率。

1.6統(tǒng)計(jì)學(xué)處理所有實(shí)驗(yàn)均重復(fù)3次，統(tǒng)計(jì)資料結(jié)果以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，兩組間比較采用t檢驗(yàn)，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用SNK法，P<0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。使用SPSS19.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

2結(jié)果

2.15-FU-PCL-NP形態(tài)觀察透射電鏡照片所示，5-FU-PCL-NP呈現(xiàn)出完好的球形形態(tài)，分布均勻無粘連情況，表明成功合成相關(guān)載藥納米材料，并且結(jié)構(gòu)穩(wěn)定（圖1）。

2.2空載納米粒子體外溶血試驗(yàn)體外溶血試驗(yàn)結(jié)果顯示，陽性對(duì)照組出現(xiàn)明顯溶血，陰性對(duì)照組及2個(gè)濃度的空載納米粒子組均未出現(xiàn)溶血。

2.35-FU載藥納米粒子的體外藥物釋放體外釋藥實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，單純5-FU在8h內(nèi)即達(dá)峰值；而5-FU-PCL-NP的釋放比較平緩，在前24h達(dá)50%，在72h后達(dá)到62.9%（圖3）。

2.45-FU-PCL-NP對(duì)Hccc-9810細(xì)胞增殖抑制作用單純5-FU及5-FU-PCL-NP分別按按5-FU藥物濃度0、5、10、15、20、40、80μg/mL與Hccc-9810細(xì)胞共培養(yǎng)48h之后，細(xì)胞活性隨藥物濃度上升而下降，5-FU-PCL-NP組對(duì)細(xì)胞的增殖抑制作用明顯強(qiáng)于單純5-FU（P<0.05）。5-FU-PCL-NP組與單純5-FU組的IC50分別為（1.32±0.12）μg/mL和（2.5±0.39）μg/mL，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）（圖4）。

2.5流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡率流式細(xì)胞儀檢測(cè)結(jié)果顯示，空白對(duì)照組和空載納米粒子組凋亡率分別為（6.5±2.4）%、（7.2±3.1）%，兩組間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）；5-FU-PCL-NP組凋亡率為（37.5±4.5）%，而單純5-FU組細(xì)胞凋亡率分別為（26.4±3.2）%，組間比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）（圖5）。

3討論

膽管癌是消化道較常見的惡性腫瘤之一，發(fā)病率呈上升趨勢(shì)，由于其惡性程度高，早期診斷困難，且因其周圍解剖結(jié)構(gòu)復(fù)雜，容易向周圍組織侵潤，手術(shù)R0切除率低（約15%~20%），預(yù)后較差，因此近年來針對(duì)膽管癌的非手術(shù)治療逐漸成為研究的熱點(diǎn)。

5-FU為治療消化道惡性腫瘤的經(jīng)典藥物，Thongprasert等報(bào)道以5-FU為基礎(chǔ)的化療組患者對(duì)膽管癌控制率可達(dá)50%。但其治療劑量較大，為增強(qiáng)療效而加大劑量會(huì)帶來毒性作用，臨床上患者表現(xiàn)為強(qiáng)烈的化療后副反應(yīng)，往往不易耐受。因此通過藥物的緩釋，減慢藥物代謝，增加作用時(shí)間窗，提高療效具有重要的臨床意義。

納米微球由于粒徑小、比表面積大，具有特殊的體積效應(yīng)和表面效應(yīng)，使之具有特殊的表面性能，包括生物黏附性、電性、親和性等，這有利于增加所載藥物在吸收部位的接觸時(shí)間和接觸面積，加之其對(duì)藥物具有明顯的保護(hù)作用，故可大大提高藥物的吸收和生物利用度，并可延長其在體內(nèi)的循環(huán)時(shí)間，大大增加作用時(shí)間窗。聚己內(nèi)酯材料是一種新型的生物可降解材料，本實(shí)驗(yàn)合成了5-FU-PCL-NP，其載藥率為15.1%，包封率為41.9%，并通過透射電鏡證明了其成功合成，具有穩(wěn)定的形態(tài)，同時(shí)體外藥物緩釋實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明單純5-FU在前8h即達(dá)峰值，而5-FU-PCL-NP的釋放在前24h達(dá)50%，說明具有一定突釋作用，后釋放趨于平穩(wěn)，至72h后達(dá)到62.9%，表明該材料具有良好的藥物緩釋作用。體外溶血試驗(yàn)結(jié)果表明，高濃度的納米材料也不會(huì)引起細(xì)胞的溶血，證明了其較好的生物安全性。CCK-8增值抑制實(shí)驗(yàn)表明5-FU-PCL-NP對(duì)腫瘤細(xì)胞的增值抑制作用優(yōu)于單純5-FU，進(jìn)一步應(yīng)用流式細(xì)胞儀檢測(cè)凋亡，結(jié)果提示5-FU-PCL-NP明顯促進(jìn)了腫瘤細(xì)胞的凋亡，表明載藥納米粒子在細(xì)胞吸收后，通過緩釋作用，增強(qiáng)了作用時(shí)間，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的凋亡增強(qiáng)了藥物的殺傷作用。

綜上所述，5-FU-PCL-NP具有良好的生物安全性，緩釋作用，可以明顯增強(qiáng)藥物的抑制增殖效果，并能誘導(dǎo)人膽管癌細(xì)胞的凋亡。本研究結(jié)果為載藥納米給藥系統(tǒng)的開發(fā)和應(yīng)用提供了一定的實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)，為膽管癌的藥物治療提供了新的思路，同時(shí)隨著后期相關(guān)官能團(tuán)的修飾，可以進(jìn)一步實(shí)現(xiàn)腫瘤的靶向治療，對(duì)于改善膽管癌患者的預(yù)后具有重要意義。

作者：李永盛賀思佳江翰邊睿王碩郝袁王雪峰劉穎斌徐雷鳴施偉斌單位：上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬新華醫(yī)院普通外科膽道研究所消化內(nèi)科