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1材料與方法

1.1Δ133p53、p53、Gadd45α、PTEN、Mdm2、Bax和CyclinB1mRNA表達(dá)的nRT-PCR檢測(cè)取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞，均勻接種于六孔板中，分別加入0、50IU/ml、100IU/ml濃度的rmhtnf，培養(yǎng)24h后收集細(xì)胞。用Trizol試劑提總RNA，紫外分光光度儀檢測(cè)mRNA濃度和純度，M-MULV第一鏈cDNA合成試劑盒逆轉(zhuǎn)錄，PremixTaqPCR擴(kuò)增。BIO-RADMyCyderPCR儀中反應(yīng)條件為94℃預(yù)變性5min，1個(gè)循環(huán)；94℃變性30s，56～58℃退火30s，72℃延伸30s，40個(gè)循環(huán)；72℃延伸10min，1個(gè)循環(huán)，反應(yīng)體系為25μl（引物序列見(jiàn)Table1）。PCR產(chǎn)物各5μl在2％瓊脂糖凝膠上電泳100V、20min，溴乙錠（EB）染色。BioSpectrumAC凝膠成像分析系統(tǒng)觀察nRT-PCR結(jié)果。

1.2統(tǒng)計(jì)學(xué)處理采用SPSS17.0軟件，各組實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以x±s表示，各組間差異采用單因素方差分析，然后兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)，兩變量間相關(guān)性采用Person直線相關(guān)分析，檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05。

2結(jié)果

2.1rmhTNF對(duì)MKN45增殖的影響不同濃度rmhTNF（50、100、200、400、500IU/ml）作用于MKN45細(xì)胞24h后，細(xì)胞抑制率，分別為23.180%±10.172%，37.219%±5.350%，48.665%±4.502%，59.830%±6.949%和70.388%±6.322%，提示rmhTNF對(duì)MKN45抑制率隨濃度增加而增加（F=35.683，P<0.001）。rmhTNF（50IU/ml）作用于MKN45細(xì)胞24、48、72h后，細(xì)胞抑制率分別為23.180%±10.172%，57.082%±4.045%，68.196%±4.108%，可見(jiàn)rmhTNF對(duì)MKN45細(xì)胞抑制率隨時(shí)間增加而增加（F=60.328，P<0.001）。

2.2不同濃度rmhTNF對(duì)Δ133p53、p53、Gadd45α、PTEN、Mdm2、Bax和CyclinB1mRNA的影響rmhTNF（0、50、100IU/ml）作用于MKN45細(xì)胞24h后，nRT-PCR結(jié)果顯示MKN45細(xì)胞Δ133p53、Mdm2、CyclinB1mRNA的表達(dá)量隨濃度增加而降低(P＜0.05)，p53、Gadd45α、PTEN、BaxmRNA的表達(dá)量隨濃度增加而增加(P＜0.05)，見(jiàn)Table2，F(xiàn)igure1。

2.3MKN45細(xì)胞中Δ133p53與p53、Gadd45α、PTEN、Mdm2、Bax、CyclinB1mRNA表達(dá)相關(guān)性MKN45細(xì)胞中隨rmhTNF作用濃度增加，Δ133p53、Mdm2、CyclinB1相對(duì)表達(dá)呈量遞減趨勢(shì)，p53、Gadd45α、PTEN、Bax相對(duì)表達(dá)量呈增長(zhǎng)趨勢(shì)。Pearson直線相關(guān)分析結(jié)果顯示，MKN45細(xì)胞Δ133p53表達(dá)水平與p53、Gadd45α、PTEN、Bax表達(dá)水平呈負(fù)相關(guān)（r=-0.916，P<0.01；r=-0.894，P<0.01；r=-0.872，P<0.01；r=-0.971，P<0.01），與Mdm2、CyclinB1表達(dá)水平呈正相關(guān)（r=0.924，P<0.01；r=0.943，P<0.01），見(jiàn)Figure2。

3討論

胃癌的發(fā)生是多種因素共同作用的結(jié)果，p53功能失活在胃癌的發(fā)生、發(fā)展過(guò)程中起重要作用。p53基因突變已有研究，但其作用機(jī)理尚未完全闡明，p53異構(gòu)體的發(fā)現(xiàn)為胃癌發(fā)生機(jī)制的研究提供了新方向。近年來(lái)，有關(guān)p53異構(gòu)體和人類腫瘤關(guān)系的研究不斷增多，發(fā)現(xiàn)Δ133p53、Δ40p53異構(gòu)體促腫瘤生長(zhǎng)，p53β、p53γ抑制腫瘤生長(zhǎng)。Δ133p53是第4內(nèi)含子的內(nèi)部啟動(dòng)子的選擇性剪接，導(dǎo)致p53蛋白氨基末端截短［9］。本課題組前期研究中，張紅梅等發(fā)現(xiàn)，Δ133p53mRNA的表達(dá)率在正常癌旁組織→淺表性胃炎→慢性胃炎→胃腺癌中逐步上升，具有顯著性差異，提示胃癌的發(fā)生過(guò)程伴隨著異構(gòu)體的動(dòng)態(tài)變化。Wei等研究結(jié)果證明，Δ133p53在幽門螺桿菌感染相關(guān)胃炎→胃癌過(guò)程中起誘導(dǎo)因子作用。這些結(jié)果提示，研究Δ133p53異構(gòu)體的功能和生物學(xué)效應(yīng)，對(duì)于理解胃癌的發(fā)生發(fā)展具有重要的價(jià)值。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，rmhTNF對(duì)MKN45胃癌細(xì)胞系的抑制率與Δ133p53mRNA的表達(dá)率相反，且隨細(xì)胞抑制率增加Δ133p53表達(dá)率升高。既往研究發(fā)現(xiàn)，Δ133p53與野生型p53具有拮抗作用，通過(guò)抑制p53的功能，而抑制細(xì)胞凋亡。Sabour等研究表明，p53可激活并上調(diào)Gadd45基因，Gadd45通過(guò)與Cdc2形成復(fù)合物，導(dǎo)致Cdc2/CyclinB1復(fù)合物解離，從而細(xì)胞周期G2/M期阻滯，同時(shí)下調(diào)CyclinB1基因。研究證實(shí)，胃癌中突變型p53的表達(dá)較胃炎組織明顯升高，而PTEN下降，提示突變型p53蛋白升高可能阻礙PTEN蛋白的表達(dá)。Bax基因是一種促凋亡基因，Marcel等通過(guò)熒光素酶實(shí)驗(yàn)研究表明，共轉(zhuǎn)染Δ133p53和FLp53異構(gòu)體之后，作用于Bax啟動(dòng)子可抑制p53的轉(zhuǎn)錄表達(dá)。以上研究表明，p53基因的生物學(xué)功能與Gadd45α、CyclinB1、PTEN、Mdm2、Bax表達(dá)密切相關(guān)。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，Δ133p53表達(dá)水平與p53、Gadd45α、PTEN、Bax表達(dá)水平呈負(fù)相關(guān)，與Mdm2、CyclinB1表達(dá)水平呈正相關(guān)，進(jìn)一步驗(yàn)證了Δ133p53對(duì)野生型p53的調(diào)控作用，這種調(diào)控體現(xiàn)在對(duì)下游分子Gadd45α、PTEN、Mdm2、Bax、CyclinB1的選擇性啟動(dòng)，提示rmhTNF對(duì)MKN45胃癌細(xì)胞系的抑制可能與該機(jī)制有關(guān)。由此可見(jiàn)，Δ133p53可能是rmhTNF治療胃癌生物學(xué)效應(yīng)的關(guān)鍵靶點(diǎn)，為胃癌診斷、治療、以及預(yù)后研究提供依據(jù)。

作者：姜琪琪 張娜 郭愛(ài) 李偉 張紅梅 季萬(wàn)勝 單位：濰坊醫(yī)學(xué)院 濰坊醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院