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摘要：

2015年6月湖北某農(nóng)戶飼養(yǎng)的150頭的育肥豬，先后出現(xiàn)了弓背喜臥、糞便干結(jié)、全身皮膚出血等癥狀。病理剖檢可見全身皮膚及心、肝、脾、肺、腎、胃、膀胱等多臟器廣泛出血斑；采集病豬病變組織，提取RNA，用豬瘟病毒基因特異性引物進行RT-PCR檢測，瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果顯示，病料呈豬瘟病毒核酸陽性，確診病豬為豬瘟病毒感染。

關(guān)鍵詞：

豬瘟；病理剖檢；RT-PCR檢測

豬瘟（ClassicalSwineFever，CSF），曾稱為豬霍亂（HogCholera，HC），在我國俗稱爛腸瘟。其是由黃病毒科瘟病毒屬的豬瘟病毒（CSFV）引起的豬的一種以高熱稽留、全身廣泛性出血、敗血和母豬繁殖障礙為特征的熱性高度致死性傳染病，曾經(jīng)給我國及世界養(yǎng)豬業(yè)的發(fā)展造成了巨大損失［1-2］。隨著豬瘟疫苗的廣泛使用，豬瘟在世界范圍內(nèi)得到了一定程度的控制，有的國家已經(jīng)消滅了豬瘟［3-4］。近年我國雖無大規(guī)模豬瘟疫情暴發(fā)，但豬瘟仍不時在一些不注重防疫的中小型養(yǎng)殖場或農(nóng)戶飼養(yǎng)的豬群中散發(fā)或流行。2015年6月湖北某農(nóng)戶飼養(yǎng)的150頭育肥豬，先后出現(xiàn)了弓背喜臥、被毛粗亂、糞便干結(jié)、眼角分泌物增多，隨后腹部及四肢內(nèi)側(cè)出現(xiàn)出血斑等癥狀，經(jīng)病理剖檢和RT-PCR診斷確診為豬瘟病毒感染。

1材料與方法

1.1試驗材料湖北某農(nóng)戶飼養(yǎng)的育肥豬病豬及剖檢采集的淋巴結(jié)和腎臟等病變組織。分子生物學試劑：Trizol試劑、RT試劑盒為Invitrogen產(chǎn)品；ExTaq酶，dNTP等PCR相關(guān)試劑為寶生物（大連）有限公司產(chǎn)品，PCR引物參照已報道的豬瘟病毒Alfort株的基因序列E2保守區(qū)［5-7］設(shè)計1對引物HCV-F/HCV-R，擴增目標片段大小約為440bp，引物由武漢擎科創(chuàng)新生物技術(shù)有限公司合成，序列分別。

1.2試驗方法

1.2.1臨床診斷與剖檢：觀察和記錄豬群病豬臨床癥狀，剖檢死亡豬只，檢查大體病變，并采取具有典型病變的組織，-70℃冷凍備用。

1.2.2總RNA提取：總RNA提取，按Trizol試劑盒操作說明進行：取具有明顯病變的淋巴結(jié)或腎臟約100mg，置于1.5mLEP管中，加入1mLTrizol，放入磁力組織破碎勻漿器具中，勻漿破碎10min，室溫靜置10min，加入200μL氯仿，用力顛倒離心管以混勻，靜置2min，12000r/min離心10min，取上層水相移至新EP管中，加入等體積的異丙醇，振蕩混勻，-20℃冰箱靜置20min，12000r/min，高速離心15min，棄上清液。加入300μL75%酒精振蕩洗滌，12000r/min離心，棄上清液。室溫靜置10mim，加入RNasefree水，-70℃冷凍保存。

1.2.3RT-PCR反應(yīng)及電泳：RT反應(yīng)采用20μL體系:5×Buffer4μL，10mM的dNTP1μL，40U/μL的RNaseinhibitor1μL，2mM的引物PR2μL，5U/μL的AMV反轉(zhuǎn)錄酶2μL，待檢RNA2.5μL，RNasefreeH2O7.5μL加入PCR管中，置PCR儀中。反應(yīng)條件為：42℃60min，95℃5min，4℃10min。PCR采用25μL反應(yīng)體系：10×ExBuffer（Mg2+）2.5μL，2.5mMdNTP2μL，HCV-F/HCV-R各1μL，反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物1μL，ExTaq0.25μL，H2O17.25μL。反應(yīng)條件為94℃預(yù)變性3min；94℃30s，55℃30s，72℃40s，30循環(huán)；72℃10min；4℃10min。PCR產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠進行檢測。

2試驗結(jié)果

2.1臨床癥狀臨床觀察豬群，豬只多被毛粗亂、弓背喜臥、眼角可見分泌物和淚斑，有的豬只糞便干結(jié)，有的稀薄，部分豬只腹部及四肢內(nèi)側(cè)皮膚可見出血斑等癥狀。

2.2剖檢病變對死亡的豬只進行剖檢，可見病豬心肌及心冠脂肪出血明顯；脾臟明顯梗死，邊緣呈鋸齒狀；腎臟表面可見針尖狀出血點，膀胱內(nèi)膜出血有大小不一的出血斑，胃內(nèi)膜出血并有潰瘍斑，見圖1。

2.3RT-PCR結(jié)果提取病變淋巴結(jié)和腎臟組織總RNA，用參照已發(fā)表的豬瘟病毒序列E2保守區(qū)設(shè)計合成的豬瘟特異性引物，進行豬瘟病毒核酸RT-PCR檢測，結(jié)果擴增出了約440bp的條帶，顯示病料呈豬瘟核酸陽性，見圖2。

3討論

典型的豬瘟往往是由強毒株引起的，開始時豬群內(nèi)可能僅有個別豬只食欲減少，神情呆滯，弓背垂尾，體溫升高，便秘［5］。隨著病程的發(fā)展，豬群內(nèi)有更多的豬發(fā)病，最初的病豬可能食欲廢絕，出現(xiàn)眼結(jié)膜炎，兩眼有多量黏液膿性分泌物，隨后下痢，有的發(fā)生嘔吐、驚厥，出現(xiàn)步態(tài)不穩(wěn)等衰弱癥狀，常在幾天內(nèi)死亡。

近年來，豬瘟的流行和發(fā)病特點已轉(zhuǎn)變?yōu)橐苑堑湫拓i瘟為主的流行形式，出現(xiàn)了臨床癥狀顯著減輕，發(fā)病率較低，潛伏期及病程較長多呈散發(fā)的溫和型豬瘟，這些病例往往病變不明顯，常需依賴實驗室診斷才能確診［6］。該研究通過對豬群進行臨床觀察，發(fā)現(xiàn)豬群癥狀符合豬瘟臨床癥狀。對死亡病豬進行剖檢發(fā)現(xiàn)，心臟、心冠脂肪、腎臟、膀胱及胃內(nèi)膜等內(nèi)臟器官廣泛性出血；脾臟梗死，邊緣呈鋸齒狀，呈現(xiàn)典型的豬瘟示病癥狀［7］。在臨床診斷、病理剖檢的基礎(chǔ)上進一步進行RT-PCR病原分子生物學檢測，擴增出了豬瘟病毒核酸，確診該豬群為豬瘟感染。對發(fā)病原因進行調(diào)查分析發(fā)現(xiàn)，養(yǎng)殖戶一直未對豬群進行豬瘟疫苗免疫，可能是造成該次發(fā)病的主要原因。這種免不免疫都無所謂的僥幸心理也有可能正是造成當前豬瘟在我國中小型養(yǎng)殖場和養(yǎng)殖戶的豬群中仍時有發(fā)生的根本原因。因此，中小型養(yǎng)殖戶一定要提高防疫意識，采取積極有效的免疫措施，進行科學養(yǎng)殖，方能降低風險，提高養(yǎng)殖經(jīng)濟效益。

作者：楊超 單位：襄陽正大農(nóng)牧食品有限公司 長江大學動物科學學院