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【摘要】目的比較大鼠新生期結(jié)直腸刺激和新生期母嬰分離兩種模型的造模效果,評價適用于慢性內(nèi)臟痛研究的模型。方法雄性新生SpragueDawley(SD)大鼠,隨機分為結(jié)直腸刺激(CI)組、母嬰分離(MS)組和對照組。CI組于出生第8~14天每天進行結(jié)直腸刺激,MS組于出生第2~21天進行母嬰分離,對照組不予處理。大鼠成年后以腹壁回撤反射(AWR)評分、痛閾測定、腹外斜肌放電(EMG)幅度等指標評價其內(nèi)臟痛覺敏化程度。結(jié)果CI組、MS組的AWR評分、EMG幅度均顯著高于對照組(P<0.05),痛閾測定顯著低于對照組(P<0.05),但兩模型組各項指標比較差別無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。結(jié)論大鼠新生期結(jié)直腸刺激和新生期母嬰分離兩種造模方法都可引起成年大鼠的內(nèi)臟痛覺敏化,造模效果基本無異,均適用于慢性內(nèi)臟痛的研究。

【關(guān)鍵詞】腸易激綜合征慢性病內(nèi)臟疾病模型動物疼痛

慢性內(nèi)臟痛是臨床常見病,同時亦是腸易激綜合征(IBS)等很多疾病的臨床表現(xiàn)之一。近年來研究認為慢性內(nèi)臟高敏感(慢性內(nèi)臟痛)是IBS胃腸動力紊亂的原因,因此受到了國內(nèi)外學(xué)者的廣泛關(guān)注。目前用于急性內(nèi)臟痛研究的模型比較成熟,而慢性內(nèi)臟痛卻缺乏穩(wěn)定可靠的動物模型,因此其研究一直滯后于急性內(nèi)臟痛和軀體痛。大鼠新生期結(jié)直腸刺激(CI)以及新生期母嬰分離(MS)是目前有報道用于研究慢性內(nèi)臟痛的兩種模型[12],筆者對兩種模型的造模效果進行比較,以評價適合用于慢性內(nèi)臟痛研究的模型。

1材料與方法

1.1材料

1.1.1動物及分組清潔級雄性新生SD大鼠3窩,每窩10~12只(福建醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心提供,許可證號SCXK[閩]20040002)。隨機將3窩新生鼠分為CI組、MS組和對照組。

1.1.2儀器20mm×2.5mm人血管重建氣囊(MedtronicAVE,美國SantaRosa公司);多道生理信號采集處理系統(tǒng)(RM6240BD,成都儀器廠);自制乳膠氣囊[1]。

1.2方法

1.2.1模型建立

1.2.1.1CI組大鼠體質(zhì)量15~18g,于出生后第8~14天每天上午用20mm×2.5mm人血管重建氣囊給予梯度壓力的結(jié)直腸擴張,氣囊連接檢壓計控制壓力,每天擴張1次,持續(xù)1min。第8~10天每天擴張前予以生理鹽水0.3mL灌腸;擴張壓力第8~10天為40mmHg（1mmHg=133.3Pa），第11~12天為60mmHg,第13~14天為80mmHg。出生后第22天斷奶,正常分籠飼養(yǎng)。

1.2.1.2MS組大鼠于出生后第2~21天,每天上午與母鼠分開放入另一籠中,移至另一鄰近房間,保持環(huán)境溫度在(32±0.5)℃,3h后放回最初籠中與母鼠團聚。出生后第22天斷奶,正常分籠飼養(yǎng)。

1.2.1.3對照組出生后不給予任何處理,與前兩組同時斷奶,在相同環(huán)境中正常飼養(yǎng)。

1.2.2模型評價指標大鼠成年后(出生后60d),體質(zhì)量約250g,剔除過輕或過重者,每組8只,雙盲法檢測。實驗時保持安靜,室溫維持在25℃左右。

1.2.2.1腹壁回撤反射(AWR)評分大鼠實驗前禁食不禁水18h,乙醚吸入麻醉,將帶有乳膠氣囊(直徑2.5cm,長6cm)的導(dǎo)管經(jīng)肛門插入直腸,使氣囊尾端距離肛門1cm,用膠帶固定導(dǎo)管于鼠尾,導(dǎo)管經(jīng)三通管連接注射器和檢壓計。將大鼠放入有機玻璃觀察箱(20cm×6cm×8cm),待其醒來并適應(yīng)環(huán)境后進行直結(jié)腸擴張(colorectaldistensions,CRD),擴張壓力分別為20,40,60,80mmHg,各壓力持續(xù)20s,間隔4min。根據(jù)大鼠反應(yīng)進行AWR評分。評分標準為[2]:0分:無明顯反應(yīng);1分:短暫的頭部運動后停止;2分:腹部肌肉收縮;3分:腹部收縮并提起;4分:弓背并抬起骨盆。各壓力重復(fù)作3次擴張并評分,取3次評分的平均數(shù)作為該壓力下的AWR評分值。

1.2.2.2痛閾測定以每次5mmHg的遞增壓力加壓,觀察大鼠在3min內(nèi)AWR評分基本穩(wěn)定保持3分的最小CRD壓力值為痛閾,重復(fù)測定3次,每次間隔4min,取平均數(shù)作為痛閾[3]。

1.2.2.3腹外斜肌放電(EMG)大鼠實驗前禁食不禁水18h,麻醉并置乳膠氣囊于直腸(方法同1.2.2.1),仰臥位固定,將銀絲雙極電極插入腹股溝韌帶上方距中線1.5cm的一側(cè)腹外斜肌上,待其清醒并適應(yīng)環(huán)境后記錄不同CRD壓力下腹外斜肌放電活動。CRD壓力分別為20,40,60,80mmHg,各壓力持續(xù)擴張20s,間隔4min。

1.2.3組織學(xué)檢查頸椎脫臼處死大鼠,取降結(jié)腸和直腸,10%福爾馬林固定,石蠟切片,HE染色,由病理學(xué)教師觀察大鼠結(jié)腸組織結(jié)構(gòu)的變化。

1.3統(tǒng)計學(xué)處理各組數(shù)據(jù)結(jié)果用x±s表示,以SPSS13.0軟件對樣本均數(shù)進行t檢驗。P<0.05為有統(tǒng)計學(xué)意義。

2結(jié)果

2.1AWR評分CI組在CRD壓力20~60mmHg、MS組在CRD壓力20~80mmHg均顯著高于對照組(P<0.05);CI組和MS組的AWR評分差別無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05,表1)。表1各組腹壁回撤反射評分n=8.1mmHg=133.3Pa.CRD:直結(jié)腸擴張.CI組:新生期結(jié)直腸刺激;MS組:新生期母嬰分離.與對照組比較,☆:P<0.05.

2.2痛閾CI組痛閾(20.42±4.25)mmHg,MS組(17.71±2.66)mmHg,均顯著低于對照組(36.25±6.22)mmHg(P<0.05),CI組和MS組痛閾差別無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。

2.3EMG平均幅值比較各CRD壓力下腹外斜肌的平均放電幅度與基礎(chǔ)放電幅度的差值,各組基礎(chǔ)放電幅度差別無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。CI組在CRD壓力20~40mmHg、MS組在20~60mmHg的EMG幅度顯著高于對照組(P<0.05),2組在各水平CRD壓力下的EMG幅度差別無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05,表2)。

2.4結(jié)直腸組織學(xué)CI組與對照組相較,結(jié)直腸黏膜無明顯改變,黏膜下層結(jié)構(gòu)完整,纖維結(jié)締組織無增生,且無淋巴細胞、漿細胞浸潤(圖1)。表2不同CRD壓力下各組腹外斜肌平均放電幅度

3討論

3.1CI模型AlChaer等最早報道的CI模型制備選在大鼠出生后8~21d內(nèi)每天給予2次CRD60mmHg刺激,從而產(chǎn)生機械傷害性刺激以及一定程度的心理應(yīng)激,導(dǎo)致成鼠出現(xiàn)臨床IBS樣表現(xiàn)[2];而本研究中CI模型則選在大鼠出生后8~14d內(nèi)每天上午給予1次CRD刺激,而且CRD壓力隨著乳鼠成長從40~80mmHg逐漸增加,證明同樣會誘發(fā)大鼠成年后持續(xù)性的內(nèi)臟痛覺敏化,且組織學(xué)檢查顯示結(jié)直腸無明顯的病理改變。應(yīng)用梯度式漸進性的CRD,避免了造模早期過高的擴張壓力可能對新生鼠腸壁造成的機械創(chuàng)傷(如結(jié)腸出血、破裂等),提高了造模的成功率。林國威等報道在大鼠出生后8~14d內(nèi)每天下午給予類似的CRD刺激亦會誘發(fā)成鼠內(nèi)臟痛覺敏化[4]。上述方法造模時間雖有所不同,但并不會顯著影響造模效果。

3.2MS模型本研究中，MS模型制備選在大鼠出生后第2~21天每天進行母嬰分離3h,利用這種早期負性生活事件造成新生期大鼠的心理應(yīng)激,從而導(dǎo)致其成年后的內(nèi)臟痛覺敏化[5],與Ren和Kalinichev等報道的MS模型造模效果一致[1,6],不同之處在于后者母嬰分離的時間選擇在出生后第2~14天,每天分離3h。這兩種方法分離時間雖有所不同,但這些早期負性生活事件都引發(fā)了一定強度的心理應(yīng)激,均可引起大鼠成年后的內(nèi)臟痛覺敏化。

3.3兩種模型比較

3.3.1操作可控性CI模型制作對操作者的熟練程度有一定要求,初學(xué)者可能會因操作不慎而在造模過程中損傷乳鼠的結(jié)直腸,從而導(dǎo)致成年后大鼠結(jié)直腸的病理學(xué)改變,甚至引起乳鼠死亡。而MS模型制作方法簡單、容易控制,即使是初學(xué)者造模也易成功。因此,MS模型在操作可控性方面占有優(yōu)勢。

3.3.2造模效果本研究用腹部EMG與AWR評分及痛閾等指標來評價內(nèi)臟痛覺敏化程度[34,7],CI組的AWR評分在CRD20~60mmHg、MS組在CRD20~80mmHg時顯著高于對照組;2組痛閾均顯著低于對照組;EMG幅度CI組在CRD20~40mmHg、MS組在CRD20~60mmHg時均顯著高于對照組。2模型組AWR評分和痛閾以及EMG幅度差別無統(tǒng)計學(xué)意義,CI模型和MS模型均引起了大鼠成年后的內(nèi)臟痛覺敏化,且兩種模型效果差別無統(tǒng)計學(xué)意義。據(jù)稱CRD壓力<60mmHg為非傷害性刺激,而≥60mmHg則為傷害性刺激[7]。EMG幅度CI組在CRD20~40mmHg、MS組在20~60mmHg時顯著高于對照組,因此CI組只對非傷害性刺激的痛覺敏感程度顯著升高,而MS組對非傷害性刺激和傷害性刺激的痛覺敏感程度均顯著升高,提示兩種模型的內(nèi)臟痛覺敏感程度可能有所不同。

本研究發(fā)現(xiàn),AWR評分與EMG反映的內(nèi)臟痛敏結(jié)果基本一致。筆者認為,AWR評分直觀易行,但作為一種半定量的測量方法,具有一定的主觀性,實驗者可通過雙盲法盡量排除主觀因素的影響;EMG測量較為客觀靈敏,但由于是在清醒狀態(tài)下記錄,易受到大鼠自主運動的影響,因此AWR和EMG兩種評價指標各有優(yōu)勢。

3.4模型選擇慢性內(nèi)臟痛的發(fā)病可能是多因素綜合作用的結(jié)果,炎癥、直腸機械性傷害刺激以及應(yīng)激等因素均可引起慢性內(nèi)臟痛[5,811]。CI模型從機械刺激和心理應(yīng)激角度模擬了內(nèi)臟痛的發(fā)病機制,MS模型主要從心理應(yīng)激角度模擬了內(nèi)臟痛的發(fā)病機制,2種模型最終都成功地誘發(fā)了大鼠成年后的慢性內(nèi)臟痛,因此均可作為慢性內(nèi)臟痛研究的模型。因2種模型模擬慢性內(nèi)臟痛的發(fā)病機制各有側(cè)重,筆者認為實驗者可根據(jù)研究目的選擇合適的模型,需要時可采用多種方式綜合造模以盡可能接近IBS的病理狀態(tài)。亦有學(xué)者提出通過心理和胃腸道生理因素的互動特征,利用條件刺激和非條件刺激來建立慢性內(nèi)臟痛模型[12],其效果有待于進一步的研究證實。