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1蛋白質(zhì)芯片的分類

蛋白質(zhì)芯片又稱蛋白質(zhì)微陣列(proteinmicroarray),根據(jù)構(gòu)建方法和用途的不同,可將蛋白質(zhì)微陣列分為分析型陣列、功能型陣列和反相陣列3類[2]。分析型陣列主要用于測定蛋白質(zhì)的表達水平、結(jié)合特異性及特定蛋白質(zhì)之間的結(jié)合親和力等;而功能型陣列包含全序列功能蛋白質(zhì)或蛋白質(zhì)結(jié)合域,主要用于研究復(fù)雜的分子間作用,如蛋白質(zhì)與蛋白質(zhì)/DNA/磷脂/小分子間的相互作用等;反相陣列與分析型陣列類似,用點樣儀將組織細胞的裂解液以陣列排布于硝酸纖維素膜載體,與特定抗體反應(yīng)后,利用化學(xué)發(fā)光法等分析得到裂解液中的抗原信息。也有根據(jù)分子間相互作用原理,將蛋白質(zhì)微陣列分為抗原-抗體陣列、受體-配體陣列和酶-底物陣列等。

2蛋白質(zhì)芯片制備技術(shù)

2.1載體選擇蛋白質(zhì)芯片的載體主要包括載玻片,膜類載體(硝酸纖維素膜、PVDF膜、尼龍膜、聚苯乙烯等)和復(fù)合材料載體。載玻片耐高溫處理,可高離子強度洗滌,背景信號低且價格低廉,在基因芯片和蛋白質(zhì)芯片中被廣泛使用。膜類載體是傳統(tǒng)蛋白質(zhì)分析方法westernblotting(免疫印跡)常用的軟基質(zhì),但其作為芯片載體具有難以克服的缺點:首先,膜類物質(zhì)表面非特異性吸附作用強,較高的背景信號會大幅降低信噪比;其次,點樣物質(zhì)在膜表面容易擴散不利于形成高濃度蛋白質(zhì)樣點;第三,膜類載體通常不能進行高密度蛋白質(zhì)點樣[3]。本實驗室研究發(fā)現(xiàn),選擇合適的封閉液可有效地減少非特異性吸附,降低背景信號;維持適當?shù)哪け砻鏉穸?可改善點樣物質(zhì)的擴散問題;膜類載體點樣密度雖不及載玻片,但可用于構(gòu)建應(yīng)用型檢測芯片。本實驗室構(gòu)建的同時檢測多病原蛋白質(zhì)芯片,結(jié)果可直接用肉眼判定,應(yīng)用前景廣闊。另外,近年來出現(xiàn)的復(fù)合載體芯片,結(jié)合了多種載體的優(yōu)點。如Lee等[4]利用金包被的硅片載體成功構(gòu)建了單分子蛋白質(zhì)納米芯片,用于分析單分子間的作用。最近有報道將硝酸纖維素膜等覆于載玻片表面構(gòu)建三維芯片,如Chatterjee等[5]利用硝酸纖維素膜涂層的載玻片構(gòu)建蛋白質(zhì)芯片,取得良好效果。三維芯片載體相對二維載玻片具有更強的蛋白質(zhì)吸附能力,表面的凝膠或纖維素可更有效地維持蛋白質(zhì)分子三維結(jié)構(gòu),降低蛋白質(zhì)分子變性。

2.2芯片點印芯片載體點印前一般需經(jīng)過洗滌、特定溶液浸泡等預(yù)處理,從而保證點樣后的蛋白質(zhì)活性。蛋白質(zhì)芯片點制多采用最初設(shè)計用來制作基因芯片的接觸式和噴墨式點樣設(shè)備。由于蛋白質(zhì)芯片的靶分子一般是具有多級結(jié)構(gòu)的蛋白質(zhì)分子,有別于基因芯片中線性的核酸分子,所以點制時一般不用基因芯片采用的原位合成法構(gòu)建。最近蛋白質(zhì)芯片在構(gòu)建方法方面也有新突破。如Tao等[6]借助體外翻譯,探索出2種簡便的蛋白質(zhì)芯片構(gòu)建方法:一種是借助固相載玻片表面固定的寡核苷酸鏈接嘌呤霉素,快速插入合成中的核糖體氨基端,使新合成的蛋白質(zhì)肽鏈被固定于載玻片表面,從而構(gòu)建蛋白質(zhì)芯片;另一種是將幾種蛋白質(zhì)的DNA合成模板經(jīng)體外轉(zhuǎn)錄得到mRNA-DNA雜交鏈點印于載玻片,經(jīng)體外翻譯、RNase處理等步驟,構(gòu)建蛋白質(zhì)芯片。相應(yīng)的測試結(jié)果顯示這兩種方法均具有較好的可操作性,并能克服現(xiàn)有芯片制作方法的部分缺陷。Chatterjee等[5]則借鑒比較成熟的DNA芯片技術(shù),將質(zhì)粒DNA點印于載玻片表面,利用質(zhì)粒可高親和力結(jié)合新合成蛋白質(zhì)的特點構(gòu)建蛋白質(zhì)芯片。

3蛋白質(zhì)芯片信號檢測技術(shù)

根據(jù)被檢測樣品液是否需要前處理,可將蛋白質(zhì)芯片的信號檢測分為直接檢測和間接檢測兩大類。

3.1直接檢測直接檢測法常用的有表面等離子共振技術(shù)(surfaceplasmonresonance,SPR),滾環(huán)擴增技術(shù)(rollingcir-clesamplification,RCA),表面增強激光解吸離子化-飛行時間質(zhì)譜法(surfaceenhancedlaserdesorptionionizationtimeofflightmassspectrometry,SELDI-TOF-MS)[7]等。SPR傳感器芯片的金膜表面固定有探針分子,當樣品液流過金膜時,特定蛋白質(zhì)與探針分子結(jié)合引起傳感器芯片表面共振角的改變,通過分析傳感圖譜的變化,便可獲取探針分子與樣品中特定蛋白質(zhì)分子相互作用信息。Koga等[8]利用SPR技術(shù),實時連續(xù)測定了細胞裂解液中400種抗體分子的表達情況。通過對SPR信號的連續(xù)繪圖發(fā)現(xiàn),當?shù)鞍踪|(zhì)芯片表面抗體量在50~1000pg時,SPR傳感器芯片檢測限可低至5μg/ml。RCA系統(tǒng)是一種可放大反應(yīng)信號的新分析方法,可用于檢測核酸分子或抗原抗體間的特異性反應(yīng)。SELDI-TOF-MS同時結(jié)合了色譜和質(zhì)譜技術(shù),主要用于微量蛋白質(zhì)的檢測。特定蛋白質(zhì)與芯片表面探針分子結(jié)合,經(jīng)激光激發(fā)為氣化肽離子后,因其飛行時間與多肽離子的質(zhì)量/電荷比成反比,故可根據(jù)肽離子從飛行時間質(zhì)量分析儀一端飛抵另一端探測器所需時間,分析比對得到檢測結(jié)果。Semmes等[9]將蛋白質(zhì)芯片與SELDI-TOF-MS技術(shù)結(jié)合,用于評估依據(jù)血清蛋白質(zhì)修飾早期診斷前列腺癌的篩查體系。SELDI-TOF-MS法可快速、大量的分析微量蛋白質(zhì),其缺點是只能分析蛋白質(zhì)的分子量,不能確定空間構(gòu)象。

3.2間接檢測間接檢測法將被檢測物用熒光染料、親合素、化學(xué)發(fā)光劑、放射性同位素等標記,通過檢測標記信號的強弱、分布等間接推斷樣品信息。熒光染料標記可兼容基因芯片信號掃描儀器,安全有效,應(yīng)用廣泛。Haab等[10]利用熒光物質(zhì)雙標記被測溶液,結(jié)果顯示其構(gòu)建的抗原/抗體微陣列的檢測限分別可達1.0ng/ml和0.1ng/ml。Colca等[11]利用光親和標記研究惡唑烷酮類(oxazolidinones)的作用機制,顯著簡化了噻唑啉二酮類敏化胰島素作用靶點的篩選過程。Mitsopoulos等[12]介紹了多種化學(xué)標記方法在基因組學(xué)和蛋白質(zhì)組學(xué)研究中的應(yīng)用。同位素標記法與熒光染料標記類似,在蛋白質(zhì)芯片標記中也有較多應(yīng)用。最近有研究報道將納米級磁性微粒、金顆粒等作為標記物,結(jié)合芯片技術(shù)檢測抗原。為探索幾種病毒的目視檢測法,LeBlanc等[13]將生物素化的病毒寡核苷酸序列固定于陣列表面,利用能與生物素特異結(jié)合的鏈親合素包被磁性微珠放大檢測信號,檢測結(jié)果可用肉眼、普通光學(xué)顯微鏡判斷。Chu等[14]利用膠體金標記第二抗體,結(jié)合銀染顯色,實現(xiàn)對抗原抗體復(fù)合物的目視檢測。基于雙抗體夾心法,本實驗室選用連接有馬來酰亞胺的納米級金顆粒標記第二抗體,配合銀染顯色,結(jié)果可用肉眼直接判定,進一步以掃描儀獲取信號,并進行灰度分析,便可實現(xiàn)對特定病原體的半定量檢測。可視化芯片對昂貴儀器的低依賴度,檢測結(jié)果用肉眼判斷,很可能成為芯片技術(shù)的研究熱點。直接檢測法可同時測定的蛋白質(zhì)含量通常較低,對特殊儀器有較高依賴性,應(yīng)用較局限。間接檢測法操作簡單,結(jié)果易分析,使用前景遠大于直接檢測法。但其在數(shù)據(jù)可信度方面仍待提高,標記分子、被標記蛋白質(zhì)間連接效率不穩(wěn)定使信號與檢測物換算困難,需盡量除去標記后游離的標記物及蛋白質(zhì)分子,保證被標記的蛋白質(zhì)分子占足夠比例,以排除游離蛋白質(zhì)對檢測的干擾。

4蛋白質(zhì)芯片在醫(yī)學(xué)診斷領(lǐng)域的應(yīng)用

蛋白質(zhì)芯片是一種大規(guī)模、高通量的分析技術(shù),它可在單次實驗中快速、簡便、平行分析數(shù)以千計的蛋白質(zhì)分子,早期主要用于蛋白質(zhì)組學(xué)研究,隨后逐漸推廣到醫(yī)學(xué)相關(guān)領(lǐng)域。近年來,蛋白質(zhì)芯片結(jié)合基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)和臨床醫(yī)學(xué),在疾病發(fā)生機制、診斷學(xué)、新藥發(fā)現(xiàn)等方面有新的突破。Lin等[15]將幽門螺桿菌(Helicobacterpylori)與十二指腸潰瘍(DU)的發(fā)病機制關(guān)聯(lián),將新發(fā)現(xiàn)的幽門螺桿菌3個潛在性與DU相關(guān)的抗原固定于蛋白質(zhì)陣列,建立了快速、便捷鑒定DU患者血清抗體類型的方法。Felgner等[16]將含有1205種假鼻疽伯克霍爾德桿菌(Burkholderiapseudomallei)的蛋白質(zhì)微陣列與類鼻疽病人血清反應(yīng),分析得到170種潛在抗原蛋白質(zhì)。進一步以這些潛在抗原構(gòu)建微陣列,并與不同地區(qū)的類鼻疽病人、其他感染類型病人及健康人群的血清反應(yīng),最終獲得49種類鼻疽特異性抗原及59種可與所有人群血清反應(yīng)的交叉反應(yīng)抗原。利用蛋白質(zhì)微陣列診斷類鼻疽的敏感性和特異性分別高達95%和83%。Song等[17]利用可解離抗體微陣列染色(DAMA)技術(shù),分析正常乳腺細胞和乳腺癌細胞中312種蛋白質(zhì)的表達修飾,發(fā)現(xiàn)5種在乳腺癌細胞中顯著高表達的蛋白質(zhì),為乳腺癌診斷提供了新的標志物。為監(jiān)測SARS(severeacuterespiratorysyndrome)的感染,Zhu等[18]構(gòu)建了冠狀病毒蛋白質(zhì)微陣列,用健康人血清驗證該方法檢測冠狀病毒感染的準確性、特異性和敏感性均大于90%。用于測定自身抗體的蛋白質(zhì)與抗原分子微陣列技術(shù)也已獲得初步應(yīng)用[19-20]。可見,芯片技術(shù)可高通量平行分析的特點使傳統(tǒng)分析方法不能實現(xiàn)的高通量數(shù)據(jù)分析成為可能。蛋白質(zhì)芯片對高親和性、高特異性抗體的要求,某種程度上也推動相關(guān)領(lǐng)域的共同發(fā)展。

5展望

蛋白質(zhì)芯片技術(shù)具有高通量、快速、微量樣品消耗等優(yōu)點,是最高效的樣品分析方法之一,但現(xiàn)階段該技術(shù)的發(fā)展和應(yīng)用仍面臨很多問題。第一,具有多級結(jié)構(gòu)的蛋白質(zhì)分子,活性易受溫度、pH、有機溶劑等因素的影響,當條件控制不當時,易使芯片表面的蛋白質(zhì)分子活性減弱甚至完全喪失。第二,蛋白質(zhì)芯片靶分子捕獲目標分子的反應(yīng)條件較之基因芯片更為苛刻,優(yōu)化反應(yīng)條件以保證檢測質(zhì)量的過程,是一項耗時費力的工作。第三,讀取信號常用的激光掃描儀價格昂貴,使用面窄,限制了芯片技術(shù)的普及。第四,蛋白質(zhì)芯片技術(shù)沒有類似于PCR的擴增技術(shù),也不存在蛋白質(zhì)測序技術(shù),無法短期內(nèi)大量獲取高純度的目的蛋白質(zhì),推廣受限。本實驗室開發(fā)的目視化測定蛋白質(zhì)芯片,點樣密度雖不及傳統(tǒng)芯片,但其具有信號可目測和對昂貴儀器低依賴性的優(yōu)勢,很可能為蛋白質(zhì)芯片技術(shù)開辟一條新的發(fā)展道路。