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作者：劉曉蘭陳鈺瑛劉惠娟

【摘要】目的：探討鼠血漿中尼莫地平血藥濃度的測定及其藥代動力學，建立HPLC測定鼠血漿中尼莫地平含量的方法。方法：采用藥效——藥代統一模型，以及HPLC測定。結果：色譜柱為HyperilC18柱（4.6×200mm，5μm），流動相為甲醇——水（87︰13），流速1.0ml/min，柱溫35℃，檢測波長240nm。尼莫地平血漿在10～3200ng·ml－1范圍，具有良好線性關系，Y=691C＋415，R=0.9998，提取回收率90.4%～103.0%，方法回收率97.0%～105.3%。大鼠灌胃給藥10mg·kg－1，20mg·kg－1，40mg·kg－1。血藥濃度時間曲線符合一級吸收的二室模型，劑量與AUC，Tmax具有良好線性關系。結論：尼莫地平在大鼠體內的處置屬于線性動力學，藥物代謝動力學參數與劑量無關。本法穩定簡單、可靠，可用于尼莫地平血藥濃度分析及藥代動力學研究。

【關鍵詞】高效液相色譜法尼莫地平血濃度藥代動力學

尼莫地平是一種臨床上治療腦血管疾病廣泛應用的鈣離子拮抗劑。本實驗探討采用高效液相色譜法測定鼠血漿中尼莫地平血藥濃度，建立HPLC測定鼠血漿中尼莫地平含量的方法及其藥代動力學。

1材料和方法

1.1藥物、動物和儀器藥品和試劑：尼莫地平某制藥廠生產，尼莫地平對照品（中國藥品生物制品檢定所），甲醇色譜純，其他試劑為分析純。動物：大鼠，體重200～250g，雌雄兼用，由省動物中心提供，給藥前禁食過夜。儀器ShimadzuLC-10ADVP液相色譜儀，ShimadzuSPD-10A二極管陣列檢測器，Class-VP5.2色譜工作站，ShimadzuLC-6A液相色譜儀，Waters486可變波長檢測，SR2000色譜數據工作站（上海三銳科技）。

1.2色譜條件色譜柱：大連依利特Hypersil-C18柱（4.6×200mm，5μm）；流動相：甲醇——水（87︰13）；流速：1.0ml/min，柱溫：35℃。測定波長240nm。

1.3對照品溶液的配制取經五氧化二磷60℃真空干燥至恒重的尼莫地平對照品約10mg，精密稱定至100ml量瓶中，加氯仿1.5ml溶解，流動相加至刻度，搖勻，即得濃度為100μg·ml－1的對照品溶液。精密量取0.1ml及2ml分別置10ml量瓶中，以甲醇稀釋至刻度，搖勻，即得濃度分別為1及20μg·ml－1的對照品溶液。

1.4大鼠血漿中尼莫地平含量的測定取大鼠血漿1ml加甲醇1ml，旋渦1min，加2mol·L－1碳酸鈉溶液100μL，旋渦1min，加環已烷4.5ml，旋渦提取3min，4000rmin－1離心10min，取上清液4ml置另一離心管中，40℃水浴中氮氣揮干，進樣前用150μL甲醇溶解，進樣50μL，外標法以樣品峰面積計算生物樣品中尼莫地平濃度。

1.5給藥劑量選擇根據預試驗結果，大鼠顯效劑量為22.5mg·kg－1；急性毒性試驗，灌胃給藥，LD50＞2.0g，故選定的試驗試量為10，20，40mg·kg－1。

1.6大鼠藥代動力學實驗實驗用大鼠216只，雌雄各半，隨機分成3組，每組雌雄各半，實驗10，20，40mg·kg－1三個劑組，取尼莫地平適量，精密稱定，用0.5%羧甲基纖維素納配成混懸液，供大量ig給藥，給藥容量為2ml·100g－1。于給藥0.5，1，1.5，2，3，4，6，8，12，16，24，32h后不同時間大鼠股動脈取血，肝素抗凝，離心分離出血漿，－18℃冰凍保存，每一時間點用6只大鼠，分別測定各鼠的血漿藥物濃度。

2試驗結果

2.1按“尼莫地平血藥濃度測定方法”項下操作，色譜圖見圖1。尼莫地平的保留時間為8.4min，內源性物質不干擾樣品測定。色譜圖見圖1A為空白，B為體外，C為體內。

2.2穩定性試驗將大鼠ig給藥后不同時間取樣后多作的血漿混合作為穩定性試驗樣本，進行以下試驗：①樣品當日提取測定作為基礎值，另將同日已提取揮干溶劑的殘渣管冷藏（0℃）放置2天后測定。②樣品冷凍，-20℃放置，冷凍后第一次融化，取樣測定。③已融化過一次的樣品再冷凍放置，冷凍一周后第二次融化，取樣測定。結果表明：與基礎值比較，在3種樣品放置條件下，P＞0.05（α=0.02），說明血樣處理吹干后，冷藏放置2天內穩定；含藥血漿冷凍放置較穩定，冷凍后融化2次對樣品含量無影響。

2.3線性關系考察取離心管數支，精密加入不同量的尼莫地平對照品溶液，以空白血漿配成濃度為10、20、60、160、400、800、1600、3200ng·ml-1的標準血漿,按“大鼠血漿中藥物濃度測定”項下操作,每種濃度2份,記錄峰面積，以尼莫地平峰面積對濃度進行加權回歸分析。結果表明尼莫地平在10～3200ng·ml-1范圍內線性良好，10mg·kg-1劑量的隨行標準曲線回歸方程為：A=591C+415,r=0.9998；20mg·kg-1劑量的隨行標準曲線回歸方程為：A=606C+264,r=0.9997；40mg·kg-1劑量的隨行標準曲線回歸方程為：A=608C+809,r=0.8887。

2.4提取回收率與方法回收率測定取離心管數支，精密加入尼莫地平不同量吹干溶劑，使含尼莫地平絕對量為60、400、3200ng,加甲醇150L溶解殘渣進樣分析，得峰面積As。另取空白血漿配成含尼莫地平60ng、400ng、3200ng·ml-1的標準血漿，按“大鼠血漿中尼莫地平濃度測定”項下操作，每種濃度5份，得血樣峰面積Ax，血樣提取物峰響應值與甲醇配制的相同濃度的尼莫地平

直接進樣峰面積比值(4.5Ax/4As×100%)即為提取回收率，將測得的峰面積代入標準曲線得到的濃度除以加入的濃度即為方法回收率。

2.5精密度試驗按“線性關系考察”項下操作，配制濃度分別為60、400、3200ng·ml-1的尼莫地平標準血漿進行分析，在同日內用同一條標準曲線及同一臺儀器進行分析，測定日內精密度；于試驗第1、2、3、4、5天，分別測定其日間精密度，計算日內相對標準差(RSD)和日間相對標準差(RSD)。

2.6靈敏測定逐級降低加入血漿中尼莫地平量，測得尼莫地平在大鼠血漿中的最小檢測限I為5ng·ml-1。

3大鼠血藥濃度

測定大鼠ig三個劑量后血漿中不同血藥濃度，血藥濃度時間曲線見圖2。將血藥濃度一時間數據分別采用3P97程序（中國藥理學會數學藥理委員會編制）[1]按一級吸收的開放一室模型，一級吸收的開放二室模型，進行模型擬合，判別指標為1.Re=∑（Ci-Ci*）2；2.AIC=NlnRe+2m經模型擬合,根據最小AIC準則,選擇二室模型為好。

4討論

4.1大鼠血藥濃度方法建立時，發現在最大波長231nm檢測，有來自溶劑中的較小的干擾，選擇240nm測定，干擾消失，雖靈敏度有所降低，但方法的靈敏度符合藥代動力學要求，故最終240nm作為設定波長。

4.2尼莫地平樣品處理直接沉淀法：分別以甲醇和乙腈做蛋白沉淀劑，提取回收率均在90%以上，但動物預試驗未能測出血藥濃度，表明本品血藥濃度低，樣品需采用液—液提取濃縮的方法處理。

4.3有機溶劑在藥物水溶液中的提取回收率結果表明：提取前應先用2mol·L-1碳酸鈉溶液堿化，堿化后的回收率大于80%。

4.4沉淀試劑的選擇根據提取液揮發的難易及空白干擾情況，沉淀蛋白可使藥物釋放出來，選擇甲醇沉淀，環乙烷提取，提取液離心易分層，兩者對組織勻漿和糞便勻漿提取率均高且相當，由于內標在此提取條件下回收率不穩定，測定方法選用外標法。

【參考文獻】

[1]衛生部藥品審評辦公室，藥物制劑人體生物利用度試驗指導原則[S]．中國臨床藥理學雜志，1992，8（3）：189～190．新晨