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葛根素（Puerarin）廣泛應(yīng)用于缺血性心腦血管疾病的治療。隨著臨床的廣泛應(yīng)用，發(fā)現(xiàn)該藥有溶血反應(yīng)、過敏反應(yīng)和肝、腎損害等嚴(yán)重不良反應(yīng)［1～10］。在國家藥品不良反應(yīng)監(jiān)測中心病例報(bào)告數(shù)據(jù)庫中，有關(guān)葛根素注射劑的嚴(yán)重不良反應(yīng)報(bào)告以急性血管內(nèi)溶血為主。葛根素注射劑導(dǎo)致急性血管內(nèi)溶血具有發(fā)病急、進(jìn)展快、病情危重的特點(diǎn)［11，12］。中國政府藥品主管部門（藥品食品監(jiān)督管理局）已多次發(fā)出加強(qiáng)管理的通告，注意葛根素注射給藥引起溶血的風(fēng)險(xiǎn)評(píng)價(jià)，并加強(qiáng)臨床監(jiān)控。在我們前期研究中發(fā)現(xiàn)，葛根素注射液在高濃度時(shí)，24條Beagle犬紅細(xì)胞的溶血概率為70％左右。本研究通過體外溶血實(shí)驗(yàn)，探討葛根素注射液對(duì)紅細(xì)胞膜脆性的影響及葛根素注射液濃度對(duì)紅細(xì)胞溶血率的關(guān)系。現(xiàn)報(bào)道如下。
1器材
1.1受試藥物葛根素注射液，購自廣州大日生物科技有限公司，批號(hào)01050801，規(guī)格：含50mg/mlPuerarin。
1.2動(dòng)物白化豚鼠，雌雄各半，體重250～400g，由廣州中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，合格證號(hào)：2003A002。飼養(yǎng)環(huán)境：室溫25～27℃，相對(duì)濕度60%～78%。Beagle犬24只（體重6～8kg，雌雄各半），由廣東省醫(yī)藥工業(yè)研究所Beagle犬養(yǎng)殖場提供，合格證號(hào)：醫(yī)動(dòng)字0014298。飼養(yǎng)環(huán)境：室溫25～27℃，相對(duì)濕度70%～80%。
1.3試劑及儀器氯化鈉注射液（NS），批號(hào)：05112102，安徽華源生物藥業(yè)有限公司生產(chǎn)；注射用水，批號(hào)：200508011，廣州鐵路中心醫(yī)院生產(chǎn)；22XLJ-II型離心沉淀機(jī)，上海醫(yī)用儀器廠；SPX－150B生化培養(yǎng)箱，上海康華生化儀器制造廠。
2方法［13］
2.1熱誘導(dǎo)法考察葛根素注射液對(duì)紅細(xì)胞膜穩(wěn)定性的影響考察葛根素注射液對(duì)beagle犬RBC的影響：將6種濃度葛根素注射液（氯化鈉注射液稀釋）分別與0.05ml50%的beagle犬RBC懸液裝于潔凈試管中，混合，搖勻，置50℃生化培養(yǎng)箱保溫30min，同時(shí)設(shè)陰性(氯化鈉注射液)及陽性(注射用水)對(duì)照管。育畢,置冰浴冷卻，2000r/min離心10min，吸取上清液,紫外分光光度計(jì)比色，于540nm下測吸光度,計(jì)算RBC溶血率。溶血率（%）＝（樣品管的吸光度－陰性對(duì)照管的吸光度）/（陽性對(duì)照管－陰性對(duì)照管的吸光度）×100%。計(jì)算平均溶血率，結(jié)果見表1及圖1。
2.2葛根素注射液對(duì)紅細(xì)胞的溶血作用
2.2.1葛根素注射液對(duì)Beagle犬紅細(xì)胞的溶血作用取狗血10ml，用牙簽不斷挑去纖維蛋白原，成脫纖血，用NS稀釋，搖勻，離心，棄上清液。沉淀的紅細(xì)胞再用NS反復(fù)洗滌2～3次，至離心后上清液無色。將所得紅細(xì)胞按其體積用NS配成2％懸液（當(dāng)天使用，使用時(shí)搖勻）。取試管6支，標(biāo)號(hào)。①～④號(hào)管分別加入5％的葛根素注射液0.1，0.2，0.4，0.8ml，加NS稀釋至2.5ml，渦旋15s使其充分溶解。各管葛根素終濃度分別為：1，2，4，8mg/ml。5號(hào)加2.5ml的NS（做陰性對(duì)照管）；上述5管與2％的紅細(xì)胞懸液2.5ml混合，搖勻。6號(hào)管加入2％的紅細(xì)胞懸液2.5ml，離心，除去NS，加注射用水溶解至5ml，搖勻，作為陽性對(duì)照管。將各管置于37℃恒溫箱孵育6h。然后觀察各管的溶血程度及血細(xì)胞的凝集；取上清液，離心，用紫外分光光度計(jì)于波長540nm下測定吸光度（OD值）。按公式：溶血率（％）＝（樣品管OD值－陰性對(duì)照管OD值）/（陽性對(duì)照管OD值－陰性對(duì)照管OD值）×100%，計(jì)算各管的溶血率。此實(shí)驗(yàn)用不同Beagle犬細(xì)胞重復(fù)4次，求4次結(jié)果的平均值。結(jié)果見表2及圖2。
2.2.2葛根素對(duì)豚鼠紅細(xì)胞的溶血作用取健康豚鼠6只，心臟采血3ml，用肝素抗凝。1500r/min離心10min，除去血清，用NS稀釋，搖勻，離心，棄上清液。沉淀的紅細(xì)胞再用NS反復(fù)洗滌2～3次，至離心后上清液無色。所得紅細(xì)胞按其體積用NS配成50％懸液（當(dāng)天使用，使用時(shí)搖勻）。每例動(dòng)物血樣取試管8支做實(shí)驗(yàn)，標(biāo)號(hào)。1～6號(hào)管分別加入5％的葛根素注射液0.025，0.05，0.1，0.15，0.20，0.25ml，加NS稀釋至2.45ml，渦旋15s使其充分溶解。各管葛根素終濃度分別為：0.5，1，2，3，4，5mg/ml。7，8號(hào)分別加NS、注射用水2.45ml作陰性及陽性對(duì)照管。上述8管均加入豚鼠50%紅細(xì)胞懸液0.05ml并混勻，置入37℃恒溫箱孵育6h，然后觀察各管的溶血程度及血細(xì)胞的凝集；取上清液，離心，于540nm下測定吸光度（OD值）。按公式：溶血率（％）＝（樣品管OD值－陰性對(duì)照管OD值）/（陽性對(duì)照管OD值－陰性對(duì)照管OD值）×100%，計(jì)算豚鼠紅細(xì)胞加入不同濃度葛根素試液孵育后的平均溶血率。結(jié)果見表3及圖3。
3結(jié)果
3.1高溫下葛根素注射液對(duì)紅細(xì)胞膜穩(wěn)定性的影響結(jié)果見表1及圖1。
表1高溫下不同濃度的葛根素注射液對(duì)Beagle犬紅細(xì)胞的溶血作用（略）
圖1高溫不同濃度葛根素注射液對(duì)Beagle犬紅細(xì)胞溶血率的影響（略）
結(jié)果顯示：熱誘導(dǎo)下，不同濃度的葛根素注射液均能加速紅細(xì)胞的破損，隨著濃度的增大紅細(xì)胞的溶血率顯著增大，相關(guān)系數(shù)r=0.9597。提示高溫條件下葛根素注射液可降低紅細(xì)胞膜的穩(wěn)定性，導(dǎo)致溶血率增大。
3.2葛根素注射液對(duì)不同動(dòng)物紅細(xì)胞的溶血作用結(jié)果見表2～3及圖2～3。
表2不同濃度的葛根素注射液對(duì)Beagle犬紅細(xì)胞的溶血作用（略）
圖2不同濃度的葛根素注射液對(duì)Beagle犬紅細(xì)胞的溶血作用（略）
表3不同濃度的葛根素注射液對(duì)豚鼠紅細(xì)胞的溶血作用（略）
圖3不同濃度的葛根素注射液對(duì)豚鼠紅細(xì)胞的溶血作用（略）
葛根素注射液均未引起B(yǎng)eagle犬紅細(xì)胞和豚鼠紅細(xì)胞出現(xiàn)凝集現(xiàn)象，但一定濃度下可引起明顯溶血。以上結(jié)果顯示：葛根素對(duì)Beagle犬紅細(xì)胞和豚鼠紅細(xì)胞的溶血作用結(jié)果相同，溶血程度與葛根素濃度呈一定的劑量相關(guān)性（相關(guān)系數(shù)r分別為0.9614和0.9227）。當(dāng)體外葛根素濃度>2mg/ml時(shí)，豚鼠紅細(xì)胞的溶血率>5%，而Beagle犬紅細(xì)胞溶血率達(dá)到24.5%，這可能與不同種屬動(dòng)物的紅細(xì)胞對(duì)葛根素的敏感性不一有關(guān)。隨著濃度的增大，Beagle犬、豚鼠紅細(xì)胞溶血率均可達(dá)到50%以上，高濃度的葛根素試液對(duì)紅細(xì)胞的溶血作用較為明顯。實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示，葛根素的溶血作用與藥物的濃度密切相關(guān)，高濃度時(shí)易引起溶血；臨床用藥應(yīng)注意葛根素注射液使用劑量及監(jiān)測血藥濃度不宜過高。
4討論
葛根素注射液系按照化學(xué)藥物標(biāo)準(zhǔn)生產(chǎn)、管理的中藥注射液，物質(zhì)基礎(chǔ)明確，可控成分在99%以上，生產(chǎn)工藝成熟，產(chǎn)品質(zhì)量穩(wěn)定，是中藥西制的成功范例。但近來發(fā)現(xiàn)，葛根素注射液可引起急性血管內(nèi)溶血，大大限制了它的臨床應(yīng)用。針對(duì)葛根素注射液的不良反應(yīng)，開展了大量研究工作。文獻(xiàn)報(bào)道可能由輔料、免疫或制劑等原因引發(fā)溶血，但未有確切的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)和理論能夠闡明不良反應(yīng)的機(jī)理，更談不上行之有效的預(yù)防和治療葛根素不良反應(yīng)的方法。臨床醫(yī)生只好慎用或不應(yīng)用。因此，闡明葛根素注射液不良反應(yīng)產(chǎn)生的機(jī)理，才有可能解決葛根素注。