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摘要:采用酮基還原酶和葡萄糖脫氫酶耦合催化方法制備他噴他多手性中間體(S)-4-(3-甲氧基苯基)-3-甲基-4-氧代丁酸甲酯［(S)-TT5］。經(jīng)過(guò)正交工藝優(yōu)化，最佳反應(yīng)條件:底物4-(3-甲氧基苯基)-3-甲基-4-氧代丁酸甲酯(TT2)濃度為66.1g/L，酮基還原酶用量為12U/gTT2，輔酶NADH用量為8g/L，反應(yīng)溫度為30℃，反應(yīng)時(shí)間為10h時(shí)，底物TT2轉(zhuǎn)化為(3S，4S)-4-羥基-4-(3-甲氧基苯基)-3-甲基丁酸甲酯((3S，4S)-TT3(主要產(chǎn)物))的收率為92.5%，d.e．99.5%;再經(jīng)次氯酸鈉氧化得(S)-TT5，收率98%，e.e．99.6%。

關(guān)鍵詞:(S)-4-(3-甲氧基苯基)-3-甲基-4-氧代丁酸甲酯;他噴他多中間體;生物催化

他噴他多(Tapentadol)是由美國(guó)強(qiáng)生制藥和德國(guó)GruenenthalGmbH公司聯(lián)合研制的新型口服鎮(zhèn)痛藥，其速釋片劑和緩釋片劑分別于2008年11月和2012年8月經(jīng)美國(guó)FDA批準(zhǔn)上市。本品是一種新型中樞鎮(zhèn)痛藥，既是阿片受體激動(dòng)藥，又是去甲腎上腺素重吸收抑制劑，鎮(zhèn)痛作用強(qiáng)，介于嗎啡和曲馬多之間，與其他阿片類鎮(zhèn)痛藥(如嗎啡、曲馬多等)相比，耐受性和依賴性更小，不良反應(yīng)(如惡心、嘔吐等)輕［1］。他噴他多分子含有2個(gè)手性碳原子，采用手性拆分方法收率低［2，3］，采用手性化學(xué)催化法則因使用昂貴的手性催化劑導(dǎo)致生產(chǎn)成本偏高［4］。生物催化法，具有原子經(jīng)濟(jì)、對(duì)映選擇性高、綠色環(huán)保、操作簡(jiǎn)便、成本低等特點(diǎn)，該方法正廣泛用于許多手性藥物及其中間體的合成，如降血脂藥阿托伐他汀(Atorvastatin)［5，6］、新型膽固醇抑制劑依折麥布(Ezetimibe)［7］、抗抑郁藥氟西汀(Fluox-etine)和度洛西汀［(S)-Duloxetine］［8，9］以及組胺類藥物倍他司汀(Betahistine)［10］等。他噴他多的合成路線如下頁(yè)所示［11］。(S)-4-(3-甲氧基苯基)-3-甲基-4-氧代丁酸甲酯［(S)-TT5］是合成他噴他多的手性中間體。本研究設(shè)計(jì)了(S)-TT5的生物合成路線:底物4-(3-甲氧基苯基)-3-甲基-4-氧代丁酸甲酯(TT2)在酮基還原酶和還原型輔酶煙酰胺腺嘌呤二核苷酸(NADH)的作用下，被一步還原為(3S，4S)-4-羥基-4-(3-甲氧基苯基)-3-甲基丁酸甲酯((3S，4S)-TT3)(主要產(chǎn)物)和(3S，4R)-TT3;反應(yīng)中利用葡萄糖脫氫酶將葡萄糖氧化實(shí)現(xiàn)氧化型NAD+的耦合還原，保證了NADH的再生。然后TT3經(jīng)次氯酸鈉氧化得手性中間體(S)-TT5。本研究方法目前尚無(wú)文獻(xiàn)報(bào)道。

1實(shí)驗(yàn)部分

1.1主要儀器與試劑LC3000I型高效液相色譜儀(山東同心科教儀器設(shè)備有限公司);RE-5250型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(上海亞榮生化儀器廠);4-16K型離心機(jī)(德國(guó)Sigma公司);GS-3型膜分離機(jī)(上海斯納普膜分離科技有限公司);EasysSiralpro型螺旋接種儀(法國(guó)Intersience公司)。自主專利菌株基因工程菌由中國(guó)微生物菌種保藏中心保藏，編號(hào)分別為CCTCCM2016101(產(chǎn)酮基還原酶，來(lái)源于木蘭假絲酵母(Candidamag-noliae)，Genbank:BAB21578.1)和CCTCCM2016102(產(chǎn)葡萄糖脫氫酶，來(lái)源于芽孢桿菌(Bacillusatrophaeus)，GenBank:AKL85515.1)。

1.2他噴他多手性中間體的合成

1.3實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1TT3的合成向5L反應(yīng)釜(有效反應(yīng)容積為4L)中依次加入1000g緩沖液(磷酸-磷酸二氫鉀反應(yīng)體系，pH7.1)、200g固體葡萄糖、按照每1g底物TT2加入250U葡萄糖脫氫酶、8U酮基還原酶以及20g輔酶NDAH的比例，混勻后加入250g(1.058mol)底物TT2，得0.265mol/L底物TT2的反應(yīng)液;于28℃保溫反應(yīng)9h，TLC(展開(kāi)劑:V(石油醚)∶V(乙酸乙酯)=2∶1))顯示反應(yīng)完全。用乙酸乙酯萃取(1.0L×3)，收集有機(jī)相，減壓濃縮，得208.1g(0.873mol)淡黃色油狀液體TT3中間體，收率82.5%。HPLC純度為99.1%(歸一化法:色譜柱OD-H手性柱(4.6mm×250mm，5m);流動(dòng)相為m(正己烷)∶m(異丙醇)∶m(二乙胺)=98∶2∶0.1;檢測(cè)波長(zhǎng)220nm;流速1mL/min;柱溫30℃)。生物催化轉(zhuǎn)化后主要產(chǎn)物是(3S，4S)-TT3，保留時(shí)間為15.48min，(3S，4R)-TT3的保留時(shí)間為16.98min，d.e．99.2%。

1.3.2(S)-TT5的合成取200g(0.846mol)TT3和500mL石油醚混勻后，于40～50℃滴加40mL(1.9mol/L)次氯酸鈉水溶液，滴畢保溫反應(yīng)3h。加入100mL乙酸乙酯，攪拌15min，靜置分層，有機(jī)相用水洗至中性;收集有機(jī)相，用無(wú)水硫酸鈉干燥、過(guò)濾，濾液減壓濃縮得188.2g淡黃色油狀液體TT5，產(chǎn)率為98%。色譜方法同上，(S)-TT5的保留時(shí)間為10.01min，少量(R)-TT5的保留時(shí)間為9.59min，e.e．99.6%。1HNMR(CDCl3，400MHz)，δ:7.40～7.46(m，1H，H-5);7.28(s，1H，H-1);7.24～7.26(m，1H，H-4);6.98～7.01(m，1H，H-3);3.80～3.84(m，1H，H-8);3.71(s，3H，H-12);3.52(s，3H，H-13);2.81～2.87(m，1H，H-9a);2.32～2.37(m，1H，H-9b);1.10～1.15(s，3H，H-11)。13CNMR(CDCl3，100MHz)，δ:202.101(C-7)，172.341(C-10)，159.594(C-2)，136.889(C-6)，129.325(C-4)，120.572(C-5)，119.081(C-3)，112.495(C-1)，54.962(C-12)，51.249(C-13)，36.996(C-8)，36.849(C-9)，17.523(C-11)。

2結(jié)果與討論

在手性中間體TT5的合成中，生物催化過(guò)程最為關(guān)鍵，通過(guò)單因素考察，葡萄糖脫氫酶為還原底物葡萄糖的NADH再生系統(tǒng)用酶，葡萄糖脫氫酶和葡萄糖的因素對(duì)反應(yīng)收率影響不大，因此為了進(jìn)一步提高生物催化效率，對(duì)底物濃度、酮基還原酶用量、輔酶NADH初始用量、反應(yīng)溫度和反應(yīng)時(shí)間進(jìn)行了5因素4水平的優(yōu)化試驗(yàn)，結(jié)果見(jiàn)表1。從正交試驗(yàn)結(jié)果可以看出，影響TT2轉(zhuǎn)化效率的因素中，影響大小依次為:底物濃度＞反應(yīng)時(shí)間＞酮基還原酶用量＞輔酶用量＞反應(yīng)溫度。其中底物濃度和反應(yīng)時(shí)間為顯著性影響因素，均方與自由度的比值F比分別為46.352和12.039(＞F臨界=9.28)。從上述試驗(yàn)結(jié)果可知，(3S，4S)-TT3的最佳生物催化工藝條件為A2、B3、C4、D2、E3，即在底物濃度66.1g/L、每1gTT2的酮基還原酶用量12U、輔酶用量8g/L、反應(yīng)溫度30℃及反應(yīng)10h時(shí)，底物TT2的轉(zhuǎn)化率最高。將底物66.1g(0.28mol)TT2溶于pH7.1的磷酸-磷酸二氫鉀緩沖溶液中，每1gTT2添加12U酮基還原酶，8g輔酶，反應(yīng)總體積1L，反應(yīng)溫度30℃，反應(yīng)10h，得61.7g(0.259mol)(3S，4S)-TT3，收率92.5%，d.e．99.5%。

3結(jié)論

利用酮基還原酶和葡萄糖脫氫酶耦合催化方法成功制備了鹽酸他噴他多手性中間體(S)-TT5。經(jīng)過(guò)工藝優(yōu)化，在底物濃度66.1g/L、每1gTT2的酮基還原酶用量為12U、輔酶用量8g/L、反應(yīng)溫度30℃及反應(yīng)10h時(shí)，底物TT2轉(zhuǎn)化為(3S，4S)-TT3的收率為92.5%，d.e．99.5%，(S)-TT5的收率為98%，e.e．99.6%。該生物催化方法具有較好的工業(yè)化應(yīng)用價(jià)值。

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作者：鄭美娟1，呂育財(cái)1，戴秋紅2，代齊敏3，龔大春*1 單位：1．三峽大學(xué)生物催化重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，2．安琪酵母股份有限公司，3．能特科技股份有限公司