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【摘要】目的利用檸檬酸三鈉作為還原劑，制備顆粒均

一、分布均勻的納米膠體金。方法通過(guò)考察反應(yīng)時(shí)間、攪拌速度以及初始沸騰時(shí)間3個(gè)因素來(lái)確定最佳的制備條件，以紫外吸收峰、粒徑及透射電鏡掃描結(jié)果進(jìn)行綜合評(píng)價(jià)。結(jié)果膠體金溶液的最佳制備條件為：在200r/min的攪拌速度加熱至沸騰，沸騰后立即加入還原劑，反應(yīng)12min后停止攪拌;所制得的膠體金的粒徑為20nm左右。結(jié)論采用優(yōu)化條件所制得的膠體金顆粒均

一、分布均勻。

【關(guān)鍵詞】膠體金;納米粒;制備方法;優(yōu)化條件

膠體金免疫層析法是20世紀(jì)90年代在美國(guó)興起的一種基于免疫膠體金技術(shù)的快速診斷技術(shù)，是在現(xiàn)代單克隆抗體技術(shù)、膠體金免疫技術(shù)和新材料技術(shù)基礎(chǔ)上發(fā)展起來(lái)的新型檢測(cè)技術(shù)。

膠體金溶液是指分散相粒子直徑在1～150nm之間的金溶膠，屬于多相不均勻體系，顏色呈桔紅色到紫紅色。1971年Faulk和Taylor將膠體金引入免疫化學(xué)中[1]，開始作為一種免疫標(biāo)記技術(shù)使用，膠體金在免疫化學(xué)中的這種應(yīng)用，又被稱為免疫金，近年來(lái)膠體金標(biāo)記已經(jīng)發(fā)展為一項(xiàng)重要的免疫標(biāo)記技術(shù)[2～3]。

膠體金的制備方法一般采用還原法，常見的有硼氫化鈉還原法(2nm)、白磷還原法(5nm)、抗壞血酸還原法(8～12nm)、檸檬酸?讒匪嶧乖?法(3～15nm)、檸檬酸三鈉還原法[4](10～150nm)，其中檸檬酸三鈉法是最經(jīng)典的方法，其基本原理是向一定濃度的金溶液內(nèi)加入一定量的檸檬酸三鈉使金離子還原變成金原子，其工藝簡(jiǎn)單，成本低廉，但在實(shí)際應(yīng)用過(guò)程中很容易出現(xiàn)顆粒聚集、重復(fù)性差等問(wèn)題，影響膠體金在免疫分析中的應(yīng)用[5]。據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，保持檸檬酸三鈉和氯金酸的摩爾比恒定可初步控制膠體金的粒徑范圍[6]，但是顆粒的均勻度和分散度卻與加熱條件及加熱時(shí)間有密切關(guān)系。

本文采用檸檬酸三鈉還原法制備膠體金，對(duì)影響氯金酸和檸檬酸三鈉水溶液反應(yīng)的幾種因素進(jìn)行優(yōu)化，選擇出最佳的反應(yīng)時(shí)間、沸騰時(shí)間以及攪拌速度，并通過(guò)紫外吸收峰、透射電鏡結(jié)果及粒徑對(duì)所制備的膠體金溶液進(jìn)行綜合評(píng)價(jià)，為制備膠體金免疫層析檢測(cè)試紙奠定基礎(chǔ)。

1試劑與儀器

1.1試劑

氯金酸(Sigma公司原裝進(jìn)口)、檸檬酸三鈉(國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司)等均為分析純，使用前未經(jīng)進(jìn)一步純化。實(shí)驗(yàn)用水均為經(jīng)超純水裝置凈化的二次去離子水，電阻率>18MΩ?cm。

1.2儀器

JJ2000B分析天平[佛蘭德(北京)電子有限公司]，SXJQ??1型數(shù)顯直流無(wú)級(jí)調(diào)速攪拌器(鄭州長(zhǎng)城科工貿(mào)有限公司)，TC??15型恒溫加熱套(海寧市華星儀器廠)，Spectronic1.70紫外可見光分光光度儀(廈門聯(lián)信誠(chéng)有限公司)，JEM??1400透射電鏡[日本電子株式會(huì)社(JEOL)]，NanoSeriesNano??ZS90型粒度測(cè)定儀(英國(guó)馬爾文儀器有限公司)。

2膠體金溶液的制備

2.1器皿的硅化

將所用器皿用酸液浸泡72h，取出，大量自來(lái)水沖洗，蒸餾水浸泡24h,干燥，用含5%的二氯二甲基硅烷的三氯甲烷溶液進(jìn)行硅化，硅化完成后用雙蒸水沖洗多次，烘干。

2.2檸檬酸三鈉還原法制備膠體金

取質(zhì)量濃度0.01%氯金酸水溶液100mL加熱至沸，攪拌下加入預(yù)熱的質(zhì)量濃度1%檸檬酸三鈉水溶液4mL，金黃色的氯金酸水溶液在2min內(nèi)變?yōu)榛疑缓笥苫疑優(yōu)榫萍t色，繼續(xù)攪拌煮沸，直至溶液呈透亮的紅色，冷卻后用雙蒸水定容至100mL，4℃冰箱中避光保存。

2.3制備膠體金條件的優(yōu)化

分別在200、250、300r/min的攪拌速度下，氯金酸水溶液煮沸0、2min，加入檸檬酸三鈉水溶液，煮沸反應(yīng)10、12min，制得膠體金溶液，然后進(jìn)行質(zhì)量鑒定。

2.4膠體金的質(zhì)量鑒定

2.4.1肉眼觀察

觀察其顏色、均勻度和透明度。

2.4.2可見光掃描鑒定

將冷卻后的膠體金溶液在400～600nm進(jìn)行掃描，確定最大吸收峰波長(zhǎng)，觀察最大吸收峰的峰形和峰寬。

2.4.3粒徑分布情況

對(duì)膠體金顆粒從數(shù)量粒度分布、體積粒度分布、強(qiáng)度粒度分布等因素對(duì)膠體金的粒徑分布情況進(jìn)行測(cè)定分析。

2.4.4透射電鏡觀察

透射電鏡下觀察膠體金顆粒的大小、均勻度、有無(wú)橢圓形及多角形、有無(wú)顆粒的聚集情況。

3結(jié)果

3.1制備條件的選取

氯金酸反應(yīng)液在加熱過(guò)程中的顏色變化時(shí)間隨溶液起始沸騰時(shí)間和攪拌轉(zhuǎn)速的不同而不同，隨著加熱時(shí)間的延長(zhǎng)，溶液顏色變化過(guò)程為淺黃色→灰色→淺藍(lán)色→紫紅色→橘紅色。本實(shí)驗(yàn)利用螺旋攪拌器轉(zhuǎn)速的可控性以及加熱套溫度的可調(diào)性，通過(guò)改變反應(yīng)過(guò)程中的攪拌速度和氯金酸溶液的初始沸騰時(shí)間以及加入還原劑后的反應(yīng)時(shí)間，選取9種不同方案的制備條件，見表1。表1制備膠體金的反應(yīng)條件

3.2膠體金質(zhì)量評(píng)價(jià)

3.2.1紫外掃描鑒定

膠體金溶液在可見光400～600nm的掃描圖譜見圖1。從圖1可見：膠體金的最大吸收峰在520～530nm范圍內(nèi)，主峰寬度較小，說(shuō)明膠體金溶液的粒徑分布較均勻;9個(gè)實(shí)驗(yàn)樣品中，7、8、9號(hào)的可見光吸收光譜的最大吸收峰明顯向長(zhǎng)波方向紅移，其他6個(gè)樣品的分散狀態(tài)良好;初步推斷攪拌速度的大小對(duì)膠體金溶液的分散狀態(tài)有明顯的決定作用。

1-9.不同條件制備的9個(gè)實(shí)驗(yàn)樣品

圖1膠體金的可見光(400～600nm)吸收光譜

Figure1Visiblespectrum(400～600nm)ofcolloidalgold

3.2.2透射電鏡掃描結(jié)果

膠體金電鏡觀察結(jié)果如圖2所示。從圖可見：樣品1形狀規(guī)則，粒徑均勻，平均粒徑為22nm;樣品2雖然形狀規(guī)則，但有一定程度的聚集現(xiàn)象;而樣品4與前兩種樣品的形狀規(guī)則度與聚集情況相比，均有一定的差異。電鏡結(jié)果與可見光吸收光譜的結(jié)果一致，說(shuō)明攪拌速度越大，樣品越容易發(fā)生聚集。

3.2.3粒徑測(cè)定結(jié)果

由可見光掃描結(jié)果與電鏡掃描結(jié)果中選出峰形較優(yōu)、顆粒較規(guī)則的膠體金的制備條件，見表2。表2膠體金的優(yōu)化制備條件

將以上樣品利用粒徑測(cè)定儀從數(shù)量粒度分布、體積粒度分布、強(qiáng)度粒度分布進(jìn)行分析，以對(duì)分布性最靈敏的強(qiáng)度粒度分布為指標(biāo)(見圖3-5)，選出膠體金顆粒均一性(單分散系)最好的制備條件。新晨

Figure5Thesizedistributionbyintensityofsample4從圖3-5可見，樣品1與其他兩種條件下制備的膠體金溶液進(jìn)行對(duì)比，具有良好的均一性，其平均粒徑為22.7nm，多分散指數(shù)(PDI)為0.201(PDI表示體系中粒徑的分散程度，數(shù)值越小表示體系中的顆粒粒度分布越集中),表明還原劑的加入時(shí)間對(duì)溶液的分布情況也有一定的影響。

綜上分析，經(jīng)過(guò)可見光吸收光譜和透射電鏡以及粒徑分布掃描的判斷，選擇本實(shí)驗(yàn)?zāi)z體金制備的最佳條件為：0.01%氯金酸水溶液100mL在200r/min的攪拌速度加熱至沸，沸騰后立即加入還原劑，反應(yīng)12min后停止攪拌，室溫冷卻，并定容至100mL。

4討論

膠體金的質(zhì)量受還原劑的用量、反應(yīng)時(shí)間、攪拌速度等因素的影響[7]。本實(shí)驗(yàn)研究證明攪拌速度是影響膠體金制備的主要因素，其次是沸騰時(shí)間和加入檸檬酸三鈉后的反應(yīng)時(shí)間。還原劑檸檬酸三鈉要一次迅速加入，不要多次加入。攪拌不均勻、攪拌速度太慢等，易造成顆粒大小不等[8]。膠體金應(yīng)放在4℃保存，避免低溫凍存，因?yàn)閮龃婵蓪?dǎo)致膠體金凝聚，破壞膠體狀態(tài)，膠體金可在4℃保存6個(gè)月左右[9]。由于膠體金的不穩(wěn)定性和聚沉的可能性，膠體金溶液宜盡快進(jìn)行標(biāo)記。

本實(shí)驗(yàn)利用調(diào)速攪拌器和加熱套作為攪拌和加熱裝置，大大改善了磁力攪拌器在攪拌過(guò)程中出現(xiàn)的漩渦現(xiàn)象以及局部受熱不均勻的情況，從而在攪拌速度合理的前提下，在反應(yīng)起始快速攪拌混勻反應(yīng)物，隨后慢速攪拌，這樣能很好地改善形成湍流的情況，從而制備出的顆粒均勻膠體金顆粒。

本實(shí)驗(yàn)通過(guò)控制還原劑的量分別制備了15nm和22nm兩種粒徑的膠體金顆粒，所加入檸檬酸三鈉的量分別為4mL和2mL，但制備結(jié)果顯示粒徑為15nm的膠體金平均粒徑在18～20nm，粒徑為22nm的平均粒徑為24～26nm左右，顯示膠體金的粒徑雖與還原劑的加入量有關(guān)，但是人為操作的誤差對(duì)粒徑大小也有一定的改變，制備過(guò)程中不能完全按照還原劑比例的多少來(lái)確定粒徑，否則對(duì)標(biāo)記會(huì)有很大影響。

本實(shí)驗(yàn)在衡量膠體金質(zhì)量的過(guò)程中增加了粒度分布情況這一指標(biāo)，從而在電鏡鑒定顆粒形狀的基礎(chǔ)上，能更好地對(duì)膠體金溶液的分布情況進(jìn)行評(píng)價(jià)，制備出質(zhì)量更優(yōu)良的膠體金溶液，為膠體金免疫層析檢測(cè)提供了切實(shí)有效的標(biāo)記材料。

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