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《體育科學研究雜志》2014年第三期

1材料與方法

1．1取樣和切片的制備取材時間在力竭運動組末次運動結束后，清醒、空腹狀態下，烏拉坦腹腔麻醉，迅速取一側脛骨前肌，置于2．5%戊二醛固定，用于制作電鏡超薄切片。取另外一側置于液氮保存，用于免疫印跡。組織取材后，從對照組、力竭E0、E24組隨機抽取6只大鼠的骨骼肌標本，立刻投入4%的多聚甲醛中固定2h以上，磷酸緩沖液清洗后在1%的鋨酸溶液中固定1h，然后按常規電鏡樣本制備方法脫水、滲透、包埋、超薄切片。在透射電鏡下定性觀察組織細胞核及線粒體等細胞器的形態變化以及肌纖維超微結構損傷程度。

1．2增殖細胞核抗原(PCNA)檢測采用westernblot法測定，電泳儀型號為DYY－6C，來自北京六一儀器廠，電泳槽型號為Mini－垂直165－8000，來自BIO－RAD公司，轉移槽型號為VE－186，來自Tanon公司，實驗過程嚴格按照標準的westernblot程序進行。

1．3統計學分析數據通過SPSS17．0統計分析，數據以標準差形式表示“X±S”，各統計學分析采用單因素方差分析和獨立樣本t檢驗，P＜0．05表示為顯著性差異，P＜0．01表示為極顯著性差異。

2結果與分析

2．1大鼠骨骼肌在大負荷運動后以及恢復期超微結構的改變電鏡顯示:大鼠安靜狀態下，清晰可見大鼠骨骼肌肌絲完整，Z線并無斷裂或是扭曲，細胞器外膜完整，內質網、線粒體均完整，并無受損。通過放大電鏡倍數，可以更加直觀的看到大鼠安靜狀態下，骨組織內肌原纖維排列整齊，z線、H帶、界線清晰，組織內各類細胞器均外膜完整，內部的基質均正常。(圖1)大鼠在大負荷運動后即刻組E0(圖2)顯示大鼠骨骼肌內肌原纖維排列不整齊，開始紊亂，z線開始扭曲，有溶解的趨勢，肌間隙開始增寬。通過放大電鏡倍數后，可以更加清晰的看到肌原纖維排列紊亂，z線扭曲，有的甚至發生溶解，H帶、I帶、M線都已經消失，無法辨別，周圍的細胞器外層膜模糊不清，肌間隙增寬，并出現空泡化。力竭運動后24h(E24組)電鏡下顯示骨骼肌內部改變，肌原纖維完全紊亂，處于扭曲的狀態，同時空泡化很嚴重，z線模糊，溶解。放大電鏡倍數顯示大鼠的肌原纖維紊亂，z線溶解，消失，周圍的細胞器空泡化增多。(圖3)

2．2增殖細胞核抗原(PCNA)的表達大負荷運動后大鼠骨骼肌內增殖細胞核抗原PCNA含量變化，其中安靜組內的PCNA含量很少，而在力竭運動組E12－E72組的增殖細胞核抗原含量均有顯著增加(P＜0．05)，顯示此時大鼠內由于損傷導致增殖細胞核抗原含量的增加，大鼠內自體修復過程在E24達到峰值(P＜0．01)。(表1，圖4)

3分析與討論

3．1大負荷運動及恢復期間大鼠骨骼肌超微結構的改變運動性骨骼肌微損傷是競技體育中常見問題，為了更加直觀的觀察與研究，目前多以動物活體實驗為主，探討骨骼肌微損傷直觀研究以及自體修復過程。Newham研究表明，肌肉牽拉練習后，可見肌節結構破壞，細胞膜通透性增高，纖維變性，巨噬細胞浸潤等組織學改變。崔玉鵬等研究大鼠不同負荷游泳運動后比目魚肌Z線變化的結果表明，肌纖維A帶拉長，H帶結構不清楚，Z線流、Z線局灶性溶解、斷裂和消失，同時觀察到線粒體和肌質網等細胞器有不同程度的腫脹和擴張。金其貫等讓大鼠進行200min的下坡跑離心運動，1次離心運動后即刻，大鼠股四頭肌的超微結構出現肌原纖維排列不規則;局部Z線不規則，變細，肌絲排列混雜卷曲。離心運動后24h，大鼠股四頭肌出現肌原纖維排列紊亂，扭曲，且具有輕度溶解、斷裂現象;Z線不規則，可見Z線流，呈鋸齒狀，局部Z線消失;T小管和肌漿網模糊不清。本實驗研究發現，安靜對照組中的肌原纖維內I/H帶、z線、細胞器等未發生改變，呈正常的超微結構特征。力竭運動組中的E24組，出現I/H帶模糊、肌原纖維完全紊亂、處于扭曲的狀態、同時空泡化很嚴重、z線也紊亂、線粒體內的嵴密集程度減少。本實驗與多數學者微損傷的研究結果相符，從力學角度來說，游泳運動模型相對于跑臺運動模型，骨骼肌的內部機械損傷刺激緩和些，因此，電鏡下觀察骨骼肌超微結構的破壞程度與跑臺模型相比輕微些。

3．2大負荷運動及恢復期間增殖細胞核抗原的變化Forrest等研究認為大強度運動后，隨著自由基的增多，細胞抗氧化能力降低，膜脂質被過氧化后，進一步攻擊位于核小體之間的組蛋白成分，導致堿基修飾、堿基丟失、單鏈和雙鏈DNA的斷裂、DNA交鏈而造成DNA損傷，引起細胞凋亡，造成骨骼肌細胞的微損傷。顧榮瑞等研究發現一次性力竭運動使大鼠股四頭肌紅肌自由基水平升高，從而導致股四頭肌紅肌生物膜的完整性喪失及損害，使肌肉工作能力下降而產生疲勞。增殖細胞核抗原(PCNA)可與蛋白因子結合參與細胞周期調控、DNA修復以及細胞凋亡等過程。由于其特殊的三聚體保守結構，不僅參與DNA復制過程同時也可與各類蛋白相互作用，達到DNA修復作用。在DNA復制過程中，PCNA作為重要的調控者，協調各個步驟有序的進行，使得不同蛋白質的結合和解離依次進行，從而確保了遺傳干細胞的迅速增殖時，將遺傳基因準確的正確的傳遞給子細胞。Parrllla和Friedrieh研究發現PCNA參與DNA的修復過程的作用以及參與的途徑并不是單一的，已證明PCNA能夠與檢驗點蛋白Radg和Husl相互作用，而Radg，Husl與Radl形成一個稱為9－1－1環狀復合體，將多種修復相關蛋白引導到損傷部位，因此PCNA可能在這個復合體中協調細胞周期阻滯與DNA損傷修復兩個功能的轉換。本實驗結果顯示，力竭運動即刻和恢復12、24、48、72小時大鼠骨骼肌PCNA表達與安靜對照組相比有顯著性差異，特別是在力竭運動的E24組表達最為明顯，表明7天力竭游泳運動導致大鼠骨骼肌出現微損傷，PCNA作為DNA的修復的參與者，發揮其特殊的生物學效應促進大鼠組織損傷修復。PCNA多作為醫學領域中與腫瘤、肺癌等癌癥疾病的分型、發展、分化程度有關，而將運動與PCNA的相關聯的報道很少，本實驗只是探討初期，仍需要進一步的探討。

4結束語

7天力竭的大負荷訓練可引起一定的骨骼肌微損傷，在力竭訓練后以及恢復期間，大鼠骨骼肌中的增殖細胞核抗原(PCNA)明顯增加，提示PCNA與肌肉微損傷的自身修復有關。

作者：王雅一單位：重慶體育科學研究所