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《電子顯微學(xué)報(bào)》2016年第5期
摘要：
超薄切片染色是透射電鏡生物樣本制備中的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。本文介紹了一種透射電鏡超薄切片染色的新方法，利用簡(jiǎn)單自制的染色液防污存儲(chǔ)與批量染色裝置，可對(duì)超薄切片載網(wǎng)進(jìn)行批量化染色，不但極大提高染色效率，而且減少了染色過(guò)程中染色液、樣品的污染，達(dá)到染色液的重復(fù)利用，同時(shí)減少重金屬對(duì)操作者的傷害和對(duì)環(huán)境的污染。
關(guān)鍵詞：
超薄切片;批量染色
在生物電鏡樣品制備中，超薄切片是一種經(jīng)典方法，電子染色是其中的關(guān)鍵步驟之一。超薄切片電子染色一般采用醋酸鈾和檸檬酸鉛為染色劑，傳統(tǒng)操作方法是:將載有超薄切片的載網(wǎng)的樣品面向下懸浮在醋酸鈾或檸檬酸鉛染液滴上，染色數(shù)分鐘后用鑷子分別夾持載網(wǎng)，將每一片載網(wǎng)依次在雙蒸水中上下反復(fù)沖洗多次，晾后使用;這種常規(guī)染色方法的缺點(diǎn)顯而易見(jiàn):①效率低下，對(duì)于大量樣品耗時(shí)長(zhǎng);②樣品染色時(shí)間不等，樣品染色不均一;③檸檬酸鉛極易與空氣中的二氧化碳結(jié)合產(chǎn)生碳酸鉛沉淀污染切片;④染色后需要對(duì)每個(gè)超薄切片載網(wǎng)分別進(jìn)行多達(dá)幾十次的清洗，費(fèi)時(shí)，費(fèi)力;⑤染液無(wú)法重復(fù)使用，消耗量大;⑥醋酸鈾和檸檬酸鉛具有一定的毒性;⑦每次需要清洗染色容器，對(duì)環(huán)境造成污染。針對(duì)常規(guī)染色技術(shù)容易出現(xiàn)的問(wèn)題，電鏡工作者和專業(yè)廠商不斷推出各種創(chuàng)新或改良方法與產(chǎn)品［1，2］，但仍存在一些問(wèn)題，如:①大部分染色裝置只能對(duì)20個(gè)左右的載網(wǎng)進(jìn)行操作，無(wú)法滿足日益增長(zhǎng)的電鏡樣品需求;②使用這些染色套裝染色完畢，仍要清洗器皿和染色板，操作繁瑣，清洗干凈與否影響下次染色質(zhì)量;③染色液無(wú)法重復(fù)使用，消耗量大;④染色裝置價(jià)格較高。本文介紹了一種染色液防污存儲(chǔ)及批量化染色的新方法［3］，此方法利用電鏡實(shí)驗(yàn)室常用的實(shí)驗(yàn)器材，簡(jiǎn)單易行，同時(shí)可對(duì)超薄切片載網(wǎng)進(jìn)行批量染色，極大提高染色效率，不但減少染色及存儲(chǔ)過(guò)程中的鉛污染，而且將染色操作與染色液存儲(chǔ)相結(jié)合，染色液重復(fù)利用，減少對(duì)環(huán)境的污染。
1實(shí)驗(yàn)材料
帶有超薄切片的載網(wǎng)，自制染色膠條(塑料薄片和雙面膠，也可購(gòu)買市售染色膠條)，固體NaOH，10mL離心管，50mL離心管、醋酸雙氧鈾、檸檬酸鉛。
2實(shí)驗(yàn)方法
(1)醋酸鈾染色液保存于15mL帶蓋離心管中，避光保存;檸檬酸鉛染液保存于10mL帶蓋離心管中，置于底部有固體NaOH的50mL離心管中(圖1)。
(2)自制染色膠條(圖2a，也可用市售染色膠條):取具有一定硬度的塑料薄片裁剪成長(zhǎng)度小于帶蓋離心管高度的染色膠條，在膠條中間段一面貼上雙面膠，用于粘著載網(wǎng)。將帶有超薄切片的載網(wǎng)粘于染色膠條的兩側(cè)，確定不會(huì)脫落;如果在膠條正反面均貼上雙面膠，則可對(duì)多達(dá)80個(gè)載網(wǎng)同時(shí)進(jìn)行染色。
(3)將帶有載網(wǎng)的膠條置于裝有醋酸鈾染色液的離心管中，蓋好管蓋，染色15～20min(圖2b)，然后用雙蒸水清洗帶有載網(wǎng)的膠條。
(4)將帶有載網(wǎng)的膠條置于裝有檸檬酸鉛染色液的10mL離心管中，敞開(kāi)離心管的管蓋，置入底部有固體NaOH的50mL離心管中，蓋緊50mL離心管蓋，染色5min(見(jiàn)圖2c)。之后取出膠條，以NaOH水溶液、雙蒸水依次清洗帶有載網(wǎng)的膠條。
(5)待載網(wǎng)干燥后用鑷子取下。
(6)醋酸鈾及檸檬酸鉛染色液無(wú)需倒出，可直接置于染色管中保存供下次使用(本實(shí)驗(yàn)室可反復(fù)染色20次以上):裝有醋酸鈾染液的15mL離心管直接蓋好管蓋即可，裝有檸檬酸鉛染液的10mL的離心管和外部的50mL離心均需蓋好管蓋。
3實(shí)驗(yàn)結(jié)果
與常規(guī)染色方法比較，新的批量染色法無(wú)需清洗染色用具，節(jié)省染色時(shí)間。而且，染液存儲(chǔ)與使用在同一容器中進(jìn)行，染液可反復(fù)使用，節(jié)省實(shí)驗(yàn)耗材，同時(shí)減少對(duì)環(huán)境污染(表1);電子顯微鏡觀察結(jié)果顯示，批量染色法所獲得電鏡圖片的對(duì)比度適中，結(jié)構(gòu)清晰，無(wú)污染。腎小球基底膜電子致密物結(jié)構(gòu)清晰可見(jiàn)(圖3a)與傳統(tǒng)染色法無(wú)明顯區(qū)別(圖3b)。以同一病人腎活檢組織塊切片，撈片后取載網(wǎng)加到使用不同使用批次的染液中，進(jìn)行染色，觀察和比較第一到第二十批次染色液所染色效果以及其染色污染情況。(100kV透射電子顯微鏡觀察檢測(cè)兩組樣品的染色效果，如圖4所示，第1(圖4a)，第10(圖4b)和第20(圖4c)次使用的染液所染樣品均污染極低。
參考文獻(xiàn):
［1］賀子義，胡冰，史永紅．提高電鏡超薄切片染色效率的自制裝置［J］．電子顯微鏡學(xué)報(bào)，2011，30(1):72－74．
［2］李錚，李虹，顏世利，等．新型一次性染色裝置改進(jìn)超薄切片染色技術(shù)［C］．電子顯微鏡學(xué)報(bào)，2012，增刊:131－132．
［3］王貝貝，王麗，洪?。环N電鏡超薄切片批量染色裝置:中國(guó)，201420368138.2［P］．2014－12－03．
作者:王貝貝 尹偉 劉雙雙 尚衛(wèi)娜 謝禮 楊平 郭建勝 王麗 洪健 單位:浙江醫(yī)學(xué)院公共技術(shù)平臺(tái) 浙江生命科學(xué)研究院 浙江省農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院 浙江大學(xué)農(nóng)生環(huán)測(cè)試中心