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《廣西植物雜志》2016年第10期

摘要:

以諾麗葉片為外植體，在添加不同激素種類和濃度的MS培養(yǎng)基上進行離體培養(yǎng)，建立兩種離體再生模式：模式Ⅰ為先脫分化愈傷組織，再分化不定根和不定芽，模式Ⅱ為直接培養(yǎng)生根后分化不定芽。結(jié)果表明：在模式Ⅰ中，誘導(dǎo)諾麗葉片產(chǎn)生愈傷組織的最優(yōu)培養(yǎng)基為MS+0.1mg•L－16-BA+2.0mg•L－12,4-D；誘導(dǎo)葉片愈傷組織再分化出不定根和不定芽的最優(yōu)培養(yǎng)基為MS+1.0mg•L－16-BA+0.4mg•L－1NAA或MS+2.0mg•L－16-BA+0.4mg•L－1NAA,其中MS+1.0mg•L－16-BA+0.4mg•L－1NAA生根時間最早為10d左右，根系較發(fā)達，而MS+2.0mg•L－16-BA+0.4mg•L－1NAA生根時間在15d左右，根系發(fā)達。在模式Ⅱ中，誘導(dǎo)葉片直接生根長芽的培養(yǎng)基為MS+1.0mg•L－16-BA+0.4mg•L－1NAA。將模式Ⅰ和模式Ⅱ中，完成諾麗葉片離體再生的苗切下后接種到MS+0.2mg•L－1NAA培養(yǎng)基中誘導(dǎo)生根，15d左右分化出不定根，45d獲得完整植株。

關(guān)鍵詞:

諾麗；植物激素；愈傷組織；再生培養(yǎng)

諾麗又稱海濱木巴戟、海巴戟天、檄樹（吳田和藍增全，2011）、（曹艷花，2014）為茜草科（Rubiales）巴戟天屬(Morinda)植物（楊小波2013），是一種熱帶常綠多年生闊葉灌木或小喬木。主要生長于溫暖潮濕的熱帶、亞熱帶地區(qū)，在國外主要分布于南太平洋諸島，如大溪地、夏威夷、印度尼西亞等，在我國主要生長于海南島、西沙群島、云南西雙版納及臺灣南部等地區(qū)（何明霞和楊清，2006）。現(xiàn)代醫(yī)學研究證明,諾麗果汁中具有免疫調(diào)節(jié)及抗腫瘤作用的多糖成分（張學梅，2000）,果實單用或與其他植物合用可治療多種疾病,被醫(yī)學研究者稱為當代神奇的治療物質(zhì)（賴茂良，2014）、（段文榮，2009）,有較高的經(jīng)濟價值。早在2000多年前，波利尼亞人就用諾麗葉片治療疾?。◤垈ッ?，2008），以及為服裝染色（白飛榮，2015）。諾麗鮮葉可以直接咀嚼，或者加水熬汁或浸泡飲用，也可曬干磨成粉末。在巴西諾麗葉被稱為“止痛草”，其對牙齦炎、牙周病、喉痛、感冒、頭疼、骨折、皮膚病等均有一定功效（楊焱，2009）。吳田（2011）以帶腋芽的莖段為外植體對諾麗進行離體培養(yǎng)，建立了高效的離體快速繁殖體系；謝江（2012）和潘曉晴（2014）分別以根和不帶腋芽的莖段為外植體，進行諾麗離體再生培養(yǎng)研究；而以諾麗葉片為外植體的離體培養(yǎng)研究還未見報道。無菌培養(yǎng)條件下，諾麗根較細，諾麗莖段較短，而諾麗葉片較大，作為外植體更容易獲得，因此，本文以諾麗無菌試管苗葉片為外植體，進行離體再生培養(yǎng)研究，以期為后續(xù)的遺傳轉(zhuǎn)化及基因改良研究奠定基礎(chǔ)。

1.材料與方法

1.1材料

實驗材料為西南林業(yè)大學園林學院組培室的諾麗無菌試管苗，取健康、無菌諾麗苗的葉片為外植體。試管苗每90d左右繼代一次，繼代培養(yǎng)基為MS+0.2mg•L－1NAA。

1.2培養(yǎng)基配制

以MS為基本培養(yǎng)基，添加不同濃度的6-BA、NAA及2,4-D，共設(shè)計38種培養(yǎng)基（表1）；再加瓊脂0.6%、蔗糖3%，pH5.8，分裝，121℃滅菌20min。

1.3接種與培養(yǎng)

將諾麗無菌苗葉片，剪去葉尖和葉緣,剪成0.5cm×0.5cm方片,正面向上放于離體再生培養(yǎng)基上，確保其與培養(yǎng)基充分接觸。每瓶培養(yǎng)基中接種5塊葉片，每種培養(yǎng)基接種10瓶。接種后，將材料置于光照強度1500lx（12h/d）、溫度(28±2)℃的條件培養(yǎng)。培養(yǎng)過程中每5d觀察1次，統(tǒng)計培養(yǎng)物的形態(tài)、顏色和生長情況。以上實驗重復(fù)3次。

1.4離體再生苗生根

將長至2-4cm的諾麗葉片離體再生苗莖尖切下后，在MS+0.2mg•L－1NAA培養(yǎng)基上繼續(xù)誘導(dǎo)生根。觀察生根時間和過程，最終獲得完整植株。

1.5數(shù)據(jù)分析

愈傷組織誘導(dǎo)率(%)=產(chǎn)生愈傷組織的外植體數(shù)/成活的外植體數(shù)；不定根分化率（%）=不定根分化的外植體數(shù)/成活外植體數(shù)；不定芽分化率（%）=不定芽分化的外植體數(shù)/成活外植體數(shù)。實驗數(shù)據(jù)用MicrosoftExcel2003和SPSS19.0統(tǒng)計軟件進行計算和方差分析，在方差分析的基礎(chǔ)上，用Duncan法進行多重比較分析。

2.結(jié)果分析

2.1先誘導(dǎo)脫分化愈傷組織，再誘導(dǎo)不定根和不定芽

2.1.1不同激素組合對葉片愈傷組織誘導(dǎo)影響

經(jīng)方差分析可知，不同激素組合對葉片愈傷組織誘導(dǎo)存在一定影響（表2）。葉片在6-BA和2,4-D配合使用的培養(yǎng)基上，脫分化能力較好，可在20d左右形成嫩黃色接近透明的疏松的愈傷組織（圖1:A）。在6-BA濃度分別為2.0、3.0、4.0mg•L-1同時配合使用NAA的培養(yǎng)基上，在培養(yǎng)15d左右沿葉片主脈出現(xiàn)膨大，并逐漸形成愈傷組織。當6-BA濃度為2.0mg•L-1，NAA濃度分別為0.1、0.2、0.3mg•L-1時，葉片能誘導(dǎo)出黃白色顆粒，質(zhì)地疏松的愈傷組織（圖1:B），但愈傷組織脫分化能力一般。當6-BA濃度為3.0mg•L-1,NAA濃度為0.1、0.2、0.3mg•L-1時，葉片能誘導(dǎo)出嫩綠色愈傷組織（圖1:C）。當NAA濃度高于0.3mg•L-1時，愈傷組織為黃褐色（圖1:D）。當6-BA濃度高于4.0mg•L-1時，愈傷組織為黃褐色且脫分化能力弱誘導(dǎo)率低。將誘導(dǎo)出的愈傷組織轉(zhuǎn)接至原培養(yǎng)基中繼續(xù)增殖繼代培養(yǎng)，每20d更換一次新鮮培養(yǎng)基，除6-BA和2,4-D配合使用的培養(yǎng)基，愈傷組織可在繼代培養(yǎng)基中不斷增殖，且愈傷組織質(zhì)地更加疏松呈泥狀，黃色接近透明；其余在6-BA和NAA配合使用的培養(yǎng)基上繼代，愈傷組織增殖能力較弱，并逐漸褐化死亡。在6-BA濃度為0.1mg•L-1，2,4-D濃度為2.0mg•L-1時，愈傷組織脫分化能力最好，誘導(dǎo)的愈傷組織質(zhì)地松散成泥狀、黃色接近透明，誘導(dǎo)20d、誘導(dǎo)率高達96.67%，并可不斷增殖繼代培養(yǎng)。因此，誘導(dǎo)諾麗葉片產(chǎn)生愈傷組織的最優(yōu)培養(yǎng)基為MS+0.1mg•L－16-BA+2.0mg•L－12,4-D。

2.1.2不同激素組合對諾麗葉片愈傷組織不定根不定芽誘導(dǎo)影響

將諾麗葉片愈傷組織轉(zhuǎn)移至芽或根誘導(dǎo)培養(yǎng)基中（表3），發(fā)現(xiàn)單獨使用6-BA無任何不定芽或不定根分化，而配合使用了NAA的培養(yǎng)基，在6-BA濃度1.0mg•L-1至2.0mg•L-1之間，不定根分化率隨NAA濃度的增加而升高；在6-BA濃度3.0mg•L-1至4.0mg•L-1之間，不定根分化率隨NAA濃度的增加而減低。同時，在6-BA濃度1.0mg•L-1，NAA濃度0.4mg•L-1和6-BA濃度2.0mg•L-1，NAA濃度0.4mg•L-1時芽分化率最高達70.67%（P＞0.05差異不顯著）。通常在分化培養(yǎng)基培養(yǎng)10-15d左右，開始分化不定根（圖2:A），而后長出發(fā)達根系（圖2:B）；40d左右時分化出不定芽（圖2:C）。綜合不定根和不定芽分化兩方面因素，諾麗葉片愈傷組織不定根不定芽誘導(dǎo)最佳培養(yǎng)基為MS+1.0mg•L－16-BA+0.4mg•L－1NAA或MS+2.0mg•L－16-BA+0.4mg•L－1NAA，兩種培養(yǎng)基之間不定芽分化率差異不顯著（P＞0.05），其中MS+1.0mg•L－16-BA+0.4mg•L－1NAA生根時間為10d左右，根系較發(fā)達；而MS+2.0mg•L－16-BA+0.1mg•L－1NAA生根時間在15d左右，根系發(fā)達。

2.2直接誘導(dǎo)生根后誘導(dǎo)不定芽

葉片在6-BA濃度為1.0至2.0mg•L-1的培養(yǎng)基中培養(yǎng)10-15d，不定根沿葉片主脈處分化（圖3:A）,隨后長成發(fā)達根系（圖3:B）；培養(yǎng)50d左右分化出不定芽（圖3:C），最終完成離體再生（圖3:D）。其中6-BA濃度1.0mg•L-1、NAA濃度0.4mg•L-1時，芽和根的分化率分別為66.67%和74%。綜合不定根和不定芽分化兩方面因素，離體葉片再生最佳培養(yǎng)基為MS+1.0mg•L－16-BA+0.4mg•L－1NAA。

2.3離體再生苗生根

將諾麗葉片完成離體再生的苗切下后接種到MS+0.2mg•L－1NAA培養(yǎng)基上繼續(xù)誘導(dǎo)生根，10d左右在切口處形成愈傷組織，15d后分化出不定根（圖4:A），30d左右分化出根系（圖4:B），45d后獲得再生苗完整植株（圖4:C）并分化出發(fā)達根系（圖4:D）。

3.結(jié)論與討論

3.1不同種類激素對葉片分化的影響

實驗以諾麗葉片為外植體，首次建立了諾麗葉片離體培養(yǎng)體系，并建立兩種不同的再生模式。對于葉片離體再生而言，外植體確定后，影響其再生率的最關(guān)鍵因素為激素。再生培養(yǎng)基中必須同時具有細胞分裂素類和生長素類物質(zhì)（周瑞金和劉孟軍，2003），在不同生長素和細胞分裂素的配合使用中，兩者的比例十分重要（孫俊，2014）。本試驗中在MS培養(yǎng)基中單獨添加6-BA，葉片不能分化不定根和不定芽，在同時添加6-BA和NAA兩種激素后完成了葉片離體培養(yǎng)，說明諾麗葉片離體培養(yǎng)中這兩種激素配合使用效果較好與大多數(shù)木本植物的研究結(jié)果一致（Chen&Hsia,2006）。培養(yǎng)基中激素的種類、濃度、配比不同造成生長能力和分化方向不同，可能是因為它們刺激了不同基因控制的酶類，從而影響內(nèi)源激素的分布水平，進而在生長和分化上形成差異（黃學林和李筱菊，1986）。

3.2不同種類生長素和濃度對葉片離體再生方式的影響

生長素的種類和濃度影響離體葉片分化不定芽的途徑，即是直接由葉片分化不定芽，還是先形成愈傷組織再分化不定芽（丁愛萍和王洪范，1996）。本試驗以諾麗葉片為外植體，建立了兩種離體再生模式（模式Ⅰ為先誘導(dǎo)愈傷組織后誘導(dǎo)不定根不定芽；模式Ⅱ為不通過愈傷組織直接誘導(dǎo)不定根后誘導(dǎo)不定芽）。諾麗葉片離體培養(yǎng)過程中，無論是哪種再生模式，愈傷組織、不定芽和不定根都是在主脈處形成，分析其原因，可能是雙子葉植物葉片主脈含有維管束，在維管束的木質(zhì)部和韌皮部之間還存在形成層（李揚漢，1984）,形成層細胞可能具有較強的分生和再生能力（柴慈江，2011），所以促進了愈傷組織、不定根和不定芽的形成。歐陽超（2014）在橡膠葉片愈傷組織誘導(dǎo)的研究中發(fā)現(xiàn)，含主脈的葉塊其愈傷組織誘導(dǎo)率明顯高于不含主脈葉塊；Vieitez（1996）等研究指出，清水鋼葉片離體培養(yǎng)中，不定芽的形成主要在葉柄和主脈形成的愈傷組織上分化。本試驗中模式Ⅰ和模式Ⅱ的離體培養(yǎng)時間分別為65d和50d左右,兩種模式使用的誘導(dǎo)時間差異主要是由于模式Ⅰ誘導(dǎo)愈傷組織的時間在20d左右，模式Ⅱ利用諾麗葉片直接再生不定芽體系，未經(jīng)愈傷組織，簡化了操作步驟，縮短了不定芽再生時間。

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作者:黃奧丹 藍增全 吳田 單位:西南林業(yè)大學環(huán)境科學與工程學院 西南林業(yè)大學園林學院