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《食品與藥品雜志》2014年第三期

1材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)取材灌胃5周后，經(jīng)腹腔注射25%烏拉坦（4mL/kg）麻醉，用碘酒、乙醇消毒膝關(guān)節(jié)后，從髕上囊部位注射1mL無菌磷酸鹽緩沖液（PBS溶液）進(jìn)入關(guān)節(jié)腔，反復(fù)活動(dòng)關(guān)節(jié)后，抽取灌洗液，做好標(biāo)記置入-80℃冰箱保存?zhèn)溆茫辉跓o菌條件下切開關(guān)節(jié)腔，取出關(guān)節(jié)并固定于10%甲醛固定液保存以備用。

1.2指標(biāo)觀察

1.2.1新西蘭兔的生活狀態(tài)每天觀察動(dòng)物生活狀態(tài)，每周稱量各組體重，繪制生長(zhǎng)曲線，觀察動(dòng)物傷口愈合情況。1.4.2股骨髁標(biāo)本的大體觀察肉眼觀察關(guān)節(jié)軟骨缺損部位的修復(fù)情況。

1.2.3病理組織學(xué)觀察用10%中性甲醛固定關(guān)節(jié)軟骨后，常規(guī)脫鈣、沖洗、脫水、包埋和切片，HE染色。光鏡下觀察病理組織學(xué)切片。

1.2.4灌洗液中的炎性因子檢測(cè)采用ELISA法檢測(cè)兔關(guān)節(jié)液中IL-1β、TNF-α的水平。按試劑盒說明檢測(cè)。

1.3統(tǒng)計(jì)分析數(shù)據(jù)均用SPSS17.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，數(shù)據(jù)結(jié)果用單因素方差分析，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2結(jié)果

2.1實(shí)驗(yàn)用兔生長(zhǎng)情況實(shí)驗(yàn)用兔的生長(zhǎng)曲線見圖1。造模后傷口愈合較好，未出現(xiàn)發(fā)炎感染等情況，觀察造模部位，無紅腫，無炎性滲出，精神狀態(tài)良好。對(duì)照組5周內(nèi)生長(zhǎng)較平穩(wěn)，其余幾組造模后體重均明顯下降，模型組下降最明顯。

2.2軟骨修復(fù)情況模型組、低分子量CS組與高分子量CS組結(jié)構(gòu)均良好，缺陷孔徑變小。然而低分子量CS組與模型組和高分子量CS相比，其軟骨表面較平整，凹陷基本填充，肉眼可見缺陷處有乳白色透明或半透明膜樣組織，顏色與正常軟骨相近，觸之較硬，質(zhì)量較好。模型組與高分子量CS組中肉眼清晰可見股骨內(nèi)髁滑車面上有凹陷，軟骨表面不平滑與周圍正常軟骨界限清楚，顏色與周圍軟骨相近。同時(shí)，其修復(fù)組織填充較慢。模型組、低分子量CS組、高分子量CS組與對(duì)照組比較，其軟骨表面與正常軟骨表面仍有一定界限。

2.3病理組織學(xué)觀察見圖2。由圖2可見，經(jīng)HE染色，損傷修復(fù)處可見初期修復(fù)反應(yīng)。模型組與給予CS組，其缺損處與對(duì)照組相比都有不同程度修復(fù)。但模型組修復(fù)程度較差，缺損處填充的多是纖維組織和肉芽組織，軟骨細(xì)胞較少，且排列較紊亂。給予CS組，損傷處被少量死骨，增生的成骨細(xì)胞及纖維組織填充，而且給予低分子量的CS組表面有增生的骨膜組織生成，表面軟骨細(xì)胞平行排列，底部可見新生骨小梁。相比之下高分子量CS組損傷處軟骨細(xì)胞和纖維組織填充較少，且無骨膜形成。

2.4關(guān)節(jié)液中IL-1β、TNF-α含量由表1可見，低分子量CS組與高分子量CS組關(guān)節(jié)液中IL-1β、TNF-α含量均低于模型組（P<0.05），且低分子量CS組中各指標(biāo)均優(yōu)于高分子量CS（P<0.05），有的指標(biāo)甚至接近對(duì)照組。但高低劑量之間的差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。

3討論

硫酸軟骨素的分子結(jié)構(gòu)主要由D-葡糖醛酸與N-乙酰半乳糖胺組成，相對(duì)分子質(zhì)量（Mr）為1.0×104～5.0×104。硫酸軟骨素的功能主要是通過組成的蛋白聚糖體現(xiàn)，大致可分為結(jié)構(gòu)功能和調(diào)節(jié)功能兩類。CS具有一定的親骨性，可進(jìn)入軟骨組織，利于提高透明質(zhì)酸含量，從而維持關(guān)節(jié)腔內(nèi)透明質(zhì)酸水平，促進(jìn)結(jié)構(gòu)蛋白合成和加強(qiáng)降低軟骨面退變，使軟骨得到較好的保護(hù)。雖然CS生物活性較高，但它在細(xì)胞轉(zhuǎn)移、分化、增殖、識(shí)別以及組織形式等生物過程中都起到了重要作用。但傳統(tǒng)CSMr較高，不易透過細(xì)胞膜，臨床應(yīng)用中主要面臨生物利用率低的問題。近年研究證明，Mr為3500~5300的硫酸軟骨素，其藥理活性最強(qiáng)，對(duì)防治風(fēng)濕性炎癥以及傷口愈合等具有更好的治療效果[7]。

研究表明，造模孔徑小于3mm，深度不夠，不能造成軟骨缺失，且缺失部位可在造模6周后部分或全部修復(fù)。很難證明，關(guān)節(jié)軟骨修復(fù)與藥物有關(guān)。因此，本實(shí)驗(yàn)通過對(duì)新西蘭兔右膝股骨內(nèi)髁滑車面鉆孔，鉆出3mm×3mm孔徑，造成關(guān)節(jié)軟骨缺失。選用低分子量CS與高分子量CS給藥，觀察其治療及修復(fù)結(jié)果，比較其不同。結(jié)果表明，CS對(duì)于軟骨的修復(fù)有較好的療效，低分子量CS與高分子量CS相比，其效果明顯，這可能是因低分子量CS分子量較小，機(jī)體容易吸收，提高了機(jī)體對(duì)CS的生物利用率。因此，低分子量CS對(duì)軟骨具有較好的修復(fù)作用。IL-1β可上調(diào)基質(zhì)金屬蛋白酶基因mRNA的表達(dá)，降解軟骨基質(zhì)；而TNF-α屬于介導(dǎo)軟骨損傷的炎癥細(xì)胞因子，能選擇性地抑制軟骨膠原產(chǎn)生，同時(shí)可抑制蛋白聚糖合成；且TNF-α和IL-1β均可導(dǎo)致軟骨基質(zhì)降解。本研究結(jié)果表明，給予低分子量CS的組別，其關(guān)節(jié)液中的IL-1β、TNF-α含量低于高分子量CS和模型組，表明低分子量CS在軟骨修復(fù)過程中降低IL-1β和TNF-α效果好于高分子量CS。軟骨修復(fù)也可能是通過影響這些因子，達(dá)到了較好的療效。目前對(duì)CS的研究主要集中在高分子量，對(duì)低分子量CS的研究較少。本實(shí)驗(yàn)探討低分子量CS對(duì)軟骨的修復(fù)作用，觀察評(píng)價(jià)其修復(fù)與愈合情況。為以后研究和應(yīng)用低分子量CS提供一定的依據(jù)。

作者：裴彤劉占濤袁洵劉坤高華單位：青島大學(xué)藥學(xué)院