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《中國(guó)科技論文雜志》2015年第二十二期

摘要：

為了制備含有咪唑基團(tuán)的水凝膠，本文將反應(yīng)制備的Im－PAA－HEAA大分子單體和聚乙二醇二丙烯酸酯（PEGDA）混合，在紫外照射下發(fā)生自由基反應(yīng)，從而得到Im－PAA－HEAA／PEGDA水凝膠。在低濃度的鋅離子溶液刺激下，水凝膠表現(xiàn)出體積收縮、吸水率下降和強(qiáng)度增強(qiáng)等響應(yīng)性，并且表現(xiàn)出良好的細(xì)胞相容性。將尿刊酸接枝于聚乙烯亞胺（PEI），制成含咪唑的非病毒基因載體（Im－PEI），該載體可以有效復(fù)合pDNA，并具有低細(xì)胞毒性和較高的轉(zhuǎn)染效率。利用鋅離子和咪唑之間的絡(luò)合作用，可以將Im－PEI／DNA復(fù)合物有效地固定于Im－PAA－HEAA／PEGDA水凝膠表面。研究結(jié)果表明：與無鋅離子作用相比，Im－PAA－HEAA／PEGDA水凝膠在鋅離子作用下能夠吸附更多的Im－PEI／DNA復(fù)合物，該水凝膠有望在反向基因轉(zhuǎn)染方面得到應(yīng)用。

關(guān)鍵詞：

水凝膠；咪唑；鋅離子響應(yīng)；基因轉(zhuǎn)染

水凝膠是通過化學(xué)或物理交聯(lián)使親水聚合物鏈聚集而形成的三維網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)［1］，可以迅速吸收并保持大量水分，而又不溶于水，是集吸水、保水、緩釋于一體的功能高分子材料。圖1為水凝膠的網(wǎng)絡(luò)示意圖［2］。水凝膠因兼具高含水量與活動(dòng)性，結(jié)構(gòu)類似于生物體，表現(xiàn)出優(yōu)良的生物相容性，可應(yīng)用于組織工程、藥物傳遞、生物傳感器等領(lǐng)域［3－4］，其中在生物領(lǐng)域應(yīng)用更加廣泛，反向基因轉(zhuǎn)染就是一個(gè)重要方面的應(yīng)用。目前，對(duì)于一些對(duì)人類健康構(gòu)成嚴(yán)重危害的疾病，如心血管疾病，惡性腫瘤，感染性疾病（如艾滋病）和遺傳性疾病（如先天免疫缺陷、血友病）等，醫(yī)學(xué)上傳統(tǒng)治療方法存在很大的局限性，與之相比，基因治療有著極大的優(yōu)勢(shì)。1989年，科學(xué)家成功將腺嘌呤脫氨酶（ADA）基因?qū)牖颊唧w內(nèi)的T淋巴細(xì)胞，治療了ADA基因缺失病，標(biāo)志著基因治療時(shí)代的開始。基因治療要求基因運(yùn)輸系統(tǒng)有效、可控，涉及材料科學(xué)、生命科學(xué)、臨床醫(yī)學(xué)等多學(xué)科領(lǐng)域。基因治療最關(guān)鍵的環(huán)節(jié)是選擇基因轉(zhuǎn)染所用的載體，它是將用于治療的目的基因輸送到病患體內(nèi)靶細(xì)胞的工具，分為病毒載體和非病毒載體兩大類。病毒載體的轉(zhuǎn)染效率非常高，但目的基因的攜帶量小，基因與載體組裝的難度大、成本高，轉(zhuǎn)染可控性差，具有高自身免疫原性和潛在致癌危害性，還有造成細(xì)胞病理改變的可能，因而其應(yīng)用受到了很大限制。非病毒載體不含病毒基因和蛋白成分，所以不具有病毒載體的高自身免疫原性和潛在致癌性，且具有基因容量大、化學(xué)結(jié)構(gòu)可設(shè)計(jì)控制，以及大量制備方便、成本低等優(yōu)點(diǎn)，引起學(xué)界越來越多的關(guān)注。

非病毒載體有陽離子脂質(zhì)體、陽離子高聚物和多功能納米材料等。非病毒載體進(jìn)行基因轉(zhuǎn)染的普遍的方法是陽離子高聚物或脂質(zhì)體通過與DNA的靜電作用形成納米級(jí)復(fù)合物。將裝載有目的基因的復(fù)合物溶液加入到細(xì)胞培養(yǎng)基中，復(fù)合物沉淀到貼壁細(xì)胞的表面，由宿主細(xì)胞通過胞吞作用吸收目的基因，之后目的基因所含DNA在細(xì)胞內(nèi)表達(dá)。這種方法需要控制較低的復(fù)合物溶液濃度，否則生物相容性差，會(huì)表現(xiàn)出毒性。而且復(fù)合物在溶液中處于流動(dòng)狀態(tài)，比較分散且不在固定位置，復(fù)合物與靶細(xì)胞的接觸機(jī)會(huì)受到限制。這些都造成非病毒載體的轉(zhuǎn)染效率低，因此提高轉(zhuǎn)染效率是非病毒載體應(yīng)用的關(guān)鍵。為了解決上述問題，近年來提出了一種反向轉(zhuǎn)染（reversetransfection）方法，用固態(tài)材料吸附DNA或載體／DNA復(fù)合物，讓其與靶細(xì)胞的溶液接觸，實(shí)現(xiàn)轉(zhuǎn)染。這種方法的轉(zhuǎn)染過程在固定位置進(jìn)行，可以實(shí)現(xiàn)目的基因在靶細(xì)胞所處的位置原位釋放。而且靶細(xì)胞接觸的目的基因量比較大，接觸機(jī)會(huì)和轉(zhuǎn)染效率得到提高［5］。Shen等［6］將DNA沉積到無機(jī)礦物質(zhì)表面制成復(fù)合物納米材料，材料表面能夠提供生物相容性好的環(huán)境，DNA濃度也高。轉(zhuǎn)染效率可以通過調(diào)節(jié)無機(jī)礦物質(zhì)的組分來調(diào)節(jié)，最佳轉(zhuǎn)染效率可以與市面上出售的化學(xué)藥劑的商品化脂質(zhì)體相當(dāng)。Rea等［7］以載體／DNA復(fù)合物吸附蛋白進(jìn)行轉(zhuǎn)染，并經(jīng)過研究發(fā)現(xiàn)蛋白的種類影響載體復(fù)合物的固定和進(jìn)入細(xì)胞后轉(zhuǎn)運(yùn)的途徑，表面吸附蛋白可以促進(jìn)細(xì)胞內(nèi)吞作用，提高轉(zhuǎn)染效率。水凝膠是一種適合作為反相轉(zhuǎn)染的介質(zhì)，對(duì)基因轉(zhuǎn)染用水凝膠的研究也開展得比較多。

Segura等［8］合成了一種可降解的透明質(zhì)酸／膠原基水凝膠，能夠通過物理作用和生物素結(jié)合作用，吸附PEI載體／DNA復(fù)合物，進(jìn)行反相基因轉(zhuǎn)染，并且能夠?qū)崿F(xiàn)控制釋放。這種凝膠還可以設(shè)計(jì)固定的圖案，將圖案以外的部分遮蔽，使靶細(xì)胞在與凝膠接觸時(shí)沿圖案的方向生長(zhǎng)，并沿這一方向在固定的區(qū)域內(nèi)被轉(zhuǎn)染。Rieux等［9］使用2種方法進(jìn)行纖維蛋白原水凝膠介導(dǎo)基因轉(zhuǎn)染：方法1，先將脂質(zhì)體復(fù)合物和細(xì)胞培養(yǎng)30min，再加入到纖維蛋白原中混合并聚合；方法2，脂質(zhì)體復(fù)合物直接與纖維蛋白原混合聚合，再將細(xì)胞接種到制成的凝膠的表面。經(jīng)過分析研究，類似反向轉(zhuǎn)染原理的方法2能夠延長(zhǎng)目的基因?qū)Π屑?xì)胞的表達(dá)時(shí)間，并且具有控釋作用。以上研究表明，水凝膠適宜作為基因轉(zhuǎn)染所用的固態(tài)生物材料，前景非常廣闊。水凝膠如用作基因轉(zhuǎn)染材料，要求其能夠?qū)NA或載體／DNA復(fù)合物通過氫鍵或化學(xué)鍵等作用形成良好的吸附。智能水凝膠在響應(yīng)刺激的情況下可以改變自身強(qiáng)度，在網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)中引入新的化學(xué)鍵，為凝膠－載體－DNA的基因轉(zhuǎn)染材質(zhì)體系提供設(shè)計(jì)思路。

1Im－PAA－HEAA／PEGDA水凝膠的制備與表征

水凝膠可以通過物理交聯(lián)和化學(xué)交聯(lián)制備。其中，采用物理交聯(lián)法制備的水凝膠的力學(xué)性能比較差，而化學(xué)交聯(lián)水凝膠則能夠克服這一缺陷［1］。一般來說，高分子主鏈或側(cè)鏈上含有大量的親水基團(tuán)和具有適當(dāng)?shù)慕宦?lián)網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)是制備水凝膠的必要前提條件［10］。聚丙烯酸（PAA，相對(duì)分子質(zhì)量為800）與N，N′－羰基二咪唑（CDI）和N－羥乙基丙烯酰胺（HEAA）反應(yīng)制成Im－PAA－HEAA大分子單體，此大分子單體和PAA單體的1HNMR譜圖如圖2所示，從中計(jì)算得到HEAA的接枝率約為20％。以聚乙二醇二丙烯酸酯（PEGDA，相對(duì)分子質(zhì)量4000）為交聯(lián)劑，2－羥基－4－（2－羥乙氧基）－2－甲基苯丙酮（Ir－gacure2959）為光引發(fā)劑，通過紫外光引發(fā)制成了大分子單體質(zhì)量分?jǐn)?shù)為10％、15％、20％的Im－PAA－HEAA／PEGDA水凝膠。平衡含水量是水凝膠的重要基本指標(biāo)之一，文中不同單體比例水凝膠的平衡含水量如圖3所示。Im－PAA－HEAA／PEGDA水凝膠的含水量很高，在磷酸緩沖鹽溶液（PBS）環(huán)境中，單體比例（質(zhì)量分?jǐn)?shù)）為10％的水凝膠含水量可達(dá)92．13％（質(zhì)量分?jǐn)?shù)），而隨著大分子單體含量的增加，水凝膠的含水量略有下降。這是由于在聚合的過程中，較高的大分子單體濃度會(huì)導(dǎo)致較高的大分子網(wǎng)絡(luò)密度，從而阻礙水向凝膠中擴(kuò)散，溶脹情況受到網(wǎng)絡(luò)密度的影響。由于咪唑和鋅離子的作用，鋅離子處理后的水凝膠使網(wǎng)絡(luò)更緊湊，網(wǎng)絡(luò)密度增大，含水量比鋅離子處理之前減少，單體比例（質(zhì)量分?jǐn)?shù)）為20％的水凝膠在經(jīng)過鋅離子處理后，平衡含水量也可以達(dá)到87．77％（質(zhì)量分?jǐn)?shù)）。不同單體比例的水凝膠經(jīng)鋅離子處理后的體積變化情況如圖4所示，微量鋅離子可以使水凝膠的體積收縮，鋅離子濃度越高，水凝膠收縮越快。低濃度（10mmol／L）鋅離子可以分別使單體比例為10％、15％和20％的水凝膠體積收縮至原體積的55％、62％和67％。單體濃度增加雖然使進(jìn)入的鋅離子與咪唑作用點(diǎn)和絡(luò)合鍵更多，但是凝膠本身的網(wǎng)絡(luò)密度也增大，具有一定剛性的PAA主鏈增多，網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)更穩(wěn)定且不易改變，絡(luò)合作用使網(wǎng)絡(luò)變緊湊。因此，單體比例為20％的水凝膠的網(wǎng)絡(luò)密度增大的比率較單體比例為10％的水凝膠的小，因此隨單體比例的增加，水凝膠的體積變化程度減小。經(jīng)過5mmol／L的ZnCl2溶液浸泡1d之后，單體比例為10％、15％、20％的水凝膠的壓縮強(qiáng)度如圖5所示，圖中數(shù)據(jù)表明凝膠的壓縮強(qiáng)度由鋅離子處理前的0．05、0．08、0．11MPa分別提高到鋅離子處理后的0．135、0．145、0．26MPa。這些結(jié)果表明，在鋅離子的作用下，水凝膠的壓縮強(qiáng)度有了大幅度的提高。水凝膠中的咪唑環(huán)和鋅離子有很強(qiáng)的結(jié)合作用，形成了絡(luò)合鍵，增加了交聯(lián)點(diǎn)，可以抵抗外界作用力，水凝膠的壓縮強(qiáng)度因此得以提高。單體濃度越高，形成絡(luò)合作用越強(qiáng)，交聯(lián)點(diǎn)越多，水凝膠的壓縮強(qiáng)度增大得越多。在水凝膠表面接種細(xì)胞，培養(yǎng)生長(zhǎng)，之后用含5mmol／L鋅離子的溶液浸泡4h，與對(duì)照組進(jìn)行對(duì)比，觀察細(xì)胞在水凝膠表面的生長(zhǎng)情況。圖6表示細(xì)胞在水凝膠表面的黏附情況，圖中可以看到2組細(xì)胞都可以很好地在水凝膠表面生長(zhǎng)，說明Im－PAA－HEAA／PEGDA水凝膠在鋅離子響應(yīng)前、后都具有比較好的生物相容性。

2Im－PEI載體／pDNA復(fù)合物水凝膠的制備及反向轉(zhuǎn)染應(yīng)用

聚乙烯亞胺（PEI）是一種使用較多的陽離子高聚物非病毒載體，在1995年由Boussif等［11］研究報(bào)道。PEI在生理環(huán)境下就能質(zhì)子化而帶正電荷，吸附、包裹帶負(fù)電荷的DNA。PEI具有“質(zhì)子海綿”特性，靶細(xì)胞通過胞吞作用吸收載體／DNA體系，載體／DNA體系在胞吞作用下進(jìn)入內(nèi)涵體、溶酶體。在內(nèi)涵體／溶酶體中，PEI能夠吸附大量氫離子導(dǎo)致氯離子滲入引發(fā)內(nèi)涵體溶脹甚至破裂，使PEI／DNA能夠逃逸出來，實(shí)現(xiàn)表達(dá)而不會(huì)被降解［12］。用尿刊酸與CDI和PEI反應(yīng)，合成的Im－PEI的核磁氫譜如圖7所示，1HNMR譜圖證明制成了接枝有咪唑基團(tuán)的Im－PEI載體，該載體在復(fù)合pDNA后，可以通過鋅離子的作用被水凝膠吸附從而進(jìn)行反向轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)（如圖8所示）。pDNA分子為兩性電解質(zhì)，在中性或偏堿性條件下，pDNA的磷酸基團(tuán)電離使核酸分子帶負(fù)電荷，從而在外加電場(chǎng)中向正極泳動(dòng)。由于PEI分子中含有大量氨基，使其帶有正電荷，當(dāng)向pDNA中加入PEI或Im－PEI時(shí)，隨著加入量的增大，載體和pD－NA之間會(huì)通過庫(kù)倫相互作用而發(fā)生坍塌縮合，電荷發(fā)生中和，阻礙pDNA向電解池陽極移動(dòng)，根據(jù)阻礙程度，可以判斷出電荷中和程度，間接反映出載體對(duì)pDNA的復(fù)合能力。載體對(duì)pDNA的有效復(fù)合將有利于pDNA在基因轉(zhuǎn)染過程中的穩(wěn)定運(yùn)載，同時(shí)保護(hù)pDNA免受核酸酶的降解，從而提高基因轉(zhuǎn)染效率。由圖9復(fù)合物與裸pDNA的電泳條帶長(zhǎng)度可以看出，當(dāng)載體與pDNA質(zhì)量的比值大于0．4時(shí)，兩者復(fù)合可有效形成復(fù)合物，Im－PEI載體有利于pDNA免受降解而穩(wěn)定運(yùn)載，載體與pDNA的復(fù)合能力隨載體與pDNA比例的增大而略有增強(qiáng)。圖10為MTT法評(píng)價(jià)合成的Im－PEI載體的細(xì)胞毒性結(jié)果圖。結(jié)果表明，Im－PEI載體生物相容性良好，載體與pDNA質(zhì)量比為2∶1和4∶1的復(fù)合物細(xì)胞存活率要高于純PEI載體／pDNA復(fù)合物，接近90％，載體與pDNA質(zhì)量比為6∶1和8∶1時(shí)細(xì)胞存活率有所降低，但也都在70％以上。圖11為熒光素酶報(bào)告基因評(píng)價(jià)載體的轉(zhuǎn)染效率結(jié)果圖，Im－PEI載體能夠有效地轉(zhuǎn)染細(xì)胞。但與作為對(duì)照的PEI相比，Im－PEI載體的轉(zhuǎn)染效率稍低，其中載體與pDNA的比值為8∶1時(shí)的轉(zhuǎn)染效率最高（如圖11所示）。綜合考慮上文的生物相容性檢測(cè)結(jié)果，以及為使載體能夠高效地與鋅離子作用從而被凝膠吸附需要咪唑有較高含量，載體與pD－NA之比為8∶1時(shí)是最為合適的選擇。通過熒光顯微鏡觀察在濃度為0．5mmol／L鋅離子的浸泡下，水凝膠吸附Im－PEI載體與綠色熒光標(biāo)記的pDNA復(fù)合物的情況，如圖12所示。沒有鋅離子存在的情況下，水凝膠與載體／pDNA復(fù)合物之間沒有比較強(qiáng)的化學(xué)鍵或作用力，復(fù)合物難以在水凝膠表面附著，即使暫時(shí)停留在水凝膠表面也很容易脫落，因此，由圖12（a）可見，復(fù)合物在水凝膠表面的吸附量很少。而同時(shí)加入鋅離子與復(fù)合物，使鋅離子與水凝膠或復(fù)合物上的咪唑環(huán)發(fā)生絡(luò)合作用，且鋅離子和兩者絡(luò)合的機(jī)會(huì)接近均等，絡(luò)合鍵同時(shí)聯(lián)結(jié)水凝膠與復(fù)合物的幾率很大，也就使水凝膠能吸附大量的載體／pDNA復(fù)合物，所以通過熒光顯微鏡能夠觀察到很多綠色光點(diǎn)，在圖12（b）中的黑白圖中表現(xiàn)為白色亮點(diǎn)。這一結(jié)果表明，本文制備的這種水凝膠有作為基因轉(zhuǎn)染固態(tài)材料應(yīng)用的潛力。

3結(jié)論

本文制備了Im－PAA－HEAA大分子單體，并通過光引發(fā)制成了該大分子單體質(zhì)量分?jǐn)?shù)為10％、15％和20％的鋅離子響應(yīng)水凝膠。單體含量的增加可以使凝膠中交聯(lián)網(wǎng)絡(luò)密度增大，網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)更趨穩(wěn)定，因此水凝膠的強(qiáng)度會(huì)隨著大分子單體濃度的增加而增加。水凝膠經(jīng)過低濃度的鋅離子浸泡處理后，由于鋅離子與咪唑基團(tuán)的作用，水凝膠體積收縮、吸水率降低、力學(xué)性能增強(qiáng)，其中單體質(zhì)量分?jǐn)?shù)為10％的水凝膠收縮率最高，單體質(zhì)量分?jǐn)?shù)為20％的水凝膠力學(xué)性能最強(qiáng)。Im－PAA－HEAA／PEGDA水凝膠具有良好的生物相容性，細(xì)胞能夠在凝膠表面生長(zhǎng)。制備的基于Im－PEI的非病毒載體，可以有效地復(fù)合pDNA，兼具低毒和高轉(zhuǎn)染效率。Im－PAA－HEAA／PEGDA水凝膠在鋅離子作用下，能夠吸附大量的Im－PEI／pDNA復(fù)合物，有望作為反向基因轉(zhuǎn)染的載體。

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作者：宋俊飛 石成望 王瑋 單位：天津大學(xué)材料科學(xué)與工程學(xué)院