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《生物工程學(xué)報雜志》2014年第六期

1發(fā)酵抑制物解除策

抑制物解除的基本策略按照處理對象的不同，可以分為3種：木質(zhì)纖維素物料脫毒、抑制物耐受菌篩選和過程控制優(yōu)化。

1.1木質(zhì)纖維素物料脫毒木質(zhì)纖維素物料脫毒是指針對酸解、堿解、汽爆等預(yù)處理后的物料，通過一定手段，去除抑制物的過程。目前木質(zhì)纖維素物料脫毒策略大體上可以分為物理法、化學(xué)法和生物法預(yù)處理3大類。物理法是直接去除水解液中的有毒物質(zhì)，而化學(xué)法和生物法在于將有毒物質(zhì)轉(zhuǎn)化為無毒物質(zhì)。目前，文獻(xiàn)已報道的物理法包括水洗法、蒸發(fā)法、吸附法、萃取法、離子交換法、電滲析法等。水洗法常用于去除汽爆預(yù)處理產(chǎn)生的可溶性發(fā)酵抑制物[9]。蒸發(fā)法是一種簡單地去除預(yù)處理水解液中乙酸和糠醛等揮發(fā)性抑制物的方法[10]。萃取法則是利用糖類與抑制物在萃取劑中溶解性的不同，用溶劑將抑制物從發(fā)酵溶液中分離出來，如采用乙酸乙酯萃取可以去除木質(zhì)纖維素水解液中56%的乙酸和所有的糠醛、香草醛和4-羥苯甲酸[11]。吸附法主要利用樹脂和活性炭具有的較強(qiáng)的吸附能力，去除水解液中的抑制物。一般地，脫毒的效果依次為陰離子交換樹脂>中性樹脂>陽離子交換樹脂[12]。在堿性條件下，陰離子交換樹脂能有效地去除陰離子和中性抑制物。活性炭對抑制物的去除效果受抑制物性質(zhì)、水解液pH、處理溫度和時間以及活性炭濃度的影響[13]。電滲析是將陰陽離子交換膜交替排列于正負(fù)電極之間，用特質(zhì)的隔板將其隔開，組成淡化和濃縮兩個系統(tǒng)，在直流電源的作用下，以電位差為推動力，利用膜材料的選擇透過性，把電解質(zhì)從溶液中分離出來，從而實現(xiàn)溶質(zhì)的分離、濃縮、精制和提純。雙極性膜是一種新型的離子交換復(fù)合膜。它由陽離子交換層(N型膜)和陰離子交換層(P型膜)復(fù)合而成，在直流電場的作用下將水離解，在膜兩層分別得到氫離子和氫氧根離子。雙極性膜電滲技術(shù)目前已經(jīng)應(yīng)用于酸的生產(chǎn)和回收工藝[14-15]。化學(xué)法主要是通過加入化學(xué)試劑使水解液中的抑制物形成沉淀或者通過調(diào)節(jié)pH使抑制物解離以去除毒性化合物的方法。目前應(yīng)用最廣泛的是1945年Leonard和Hajny[16]報道的過量堿法(Overliming)，即先向預(yù)水解液中加入Ca(OH)2，調(diào)節(jié)pH到9−12，使抑制物沉淀，經(jīng)過離心后再向得到的上清水解液中加入稀硫酸，調(diào)節(jié)pH到5.5。生物法是指利用酶或者微生物的降解作用以達(dá)到改變抑制物結(jié)構(gòu)、降低毒性的方法[17]。生物法可分為酶處理和微生物處理。由于酶具有專一性，所以酶處理只能去除特定的抑制物。漆酶對酚類化合物的去除作用是明顯的，但對于乙酸、糠醛和羥甲基糠醛無去除作用[18]。灰蓋鬼傘擔(dān)子菌CoprinuscinereusIFO8371生產(chǎn)的過氧化物酶在H2O2存在的情況下，可以將香豆酸、阿魏酸、4-羥基苯甲酸、香草醛、紫丁香醛、香草酸6種化合物轉(zhuǎn)化成高分子量化合物，從而提高拜氏梭菌Clostridiumbeijerinckii利用木質(zhì)纖維素水解液發(fā)酵丁醇的性能[19]。微生物脫毒指的是利用絲狀軟腐菌Trichodermareesei等微生物，去除水解液中乙酸、糠醛和安息香酸衍生物等的方法。例如，利用絲狀軟腐菌處理蒸汽爆破預(yù)處理過的柳樹半纖維素水解液，乙醇的產(chǎn)率可以提升3−4倍[20]。不同抑制物去除方法的優(yōu)缺點對比見表1。

1.2抑制物耐受菌選育物理、化學(xué)或生物等脫毒方法只能部分去除纖維素水解液中的抑制物，無法完全克服抑制物對宿主細(xì)胞的毒害作用，并且生物脫毒的費用一般占到總投入的30%−40%，幾乎是木質(zhì)纖維素生物轉(zhuǎn)化過程中投入最大的一項工序，使得諸如丁醇等發(fā)酵產(chǎn)物進(jìn)一步降低了自己在同類產(chǎn)品中的競爭力[21]。因此，從發(fā)酵微生物本身出發(fā)選育高耐受的菌株，則成為解決底物抑制物問題的另一種有效方法。根據(jù)育種方式的不同，可以分為傳統(tǒng)誘變、代謝工程和合成生物學(xué)。傳統(tǒng)誘變是指通過一些強(qiáng)烈的化學(xué)誘變因子，如甲基磺酸乙酯(EMS)、亞硝基胍(NTC)、丙烯醇等，以及紫外線等物理誘變條件對出發(fā)菌進(jìn)行誘變以獲取抑制物耐受菌株的方法。由于單一的誘變方法具有菌種性狀不穩(wěn)定、突變方向隨機(jī)等缺點，最近幾年的研究多集中于復(fù)合誘變和菌種馴化。復(fù)合誘變是指利用多種誘變劑同時或者依次對出發(fā)菌進(jìn)行處理。誘變劑的復(fù)合處理有一定的協(xié)同誘變效應(yīng)，能增強(qiáng)誘變效果，并能將多種優(yōu)良性狀集中于同一菌株[22]。馴化是指讓細(xì)胞長期在某一環(huán)境下生長，使其能夠適應(yīng)并具有良好性狀的進(jìn)化過程。馴化是在對機(jī)理知識理解不足的情況下獲得具有目標(biāo)特性菌株的有效方法。丁明珠等以釀酒酵母為出發(fā)菌種，通過紫外誘變結(jié)合馴化的方法篩選出1株對于糠醛、苯酚和乙酸都有很強(qiáng)耐受能力的菌株[23]。Keating等[24]利用糠醛、5-羥甲基糠醛和乙酸溶液對釀酒酵母進(jìn)行馴化，得到了一株在纖維素水解液中具有良好發(fā)酵效果的酵母菌株。Liu等[25]也利用馴化的方法得到了能耐受糠醛的酵母菌株，從而實現(xiàn)了對纖維素水解液中糠醛抑制物的原位脫毒。分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展，使得產(chǎn)溶劑梭菌代謝工程改造成為了可能，外源基因和調(diào)控因子的引入，使代謝工程有別與傳統(tǒng)意義上的菌種改造。利用重組技術(shù)調(diào)控細(xì)胞中酶反應(yīng)、優(yōu)化代謝物的轉(zhuǎn)化與轉(zhuǎn)運，可以有效增強(qiáng)宿主細(xì)胞對于抑制物的耐受能力。楊雪雪[26]對釀酒酵母同源二倍體單基因缺失株文庫進(jìn)行篩選，經(jīng)過初篩、復(fù)篩、驗證等步驟，得到了163個糠醛抗性相關(guān)基因，并成功構(gòu)造出雙倍體單基因缺失株siz1/siz1，dep1/dep1，sap30/sap30和單倍體單基因缺失株siz1，dep1，sap30菌株，其對10mmol/L糠醛的抗性比各自相應(yīng)的野生型菌株要高出100倍。Li等[27]利用酵母全基因組表達(dá)譜芯片，研究了釀酒酵母在轉(zhuǎn)錄組水平上對糠醛和醋酸的代謝響應(yīng)，發(fā)現(xiàn)增強(qiáng)HMG1基因可以提高胞內(nèi)糠醛的轉(zhuǎn)化效率，從而增強(qiáng)菌體的耐受能力。Gorsich等[28]通過對釀酒酵母單基因突變體庫的篩選找到62種與糠醛耐受性相關(guān)的基因。過表達(dá)其中的葡萄糖-6-磷酸脫氫酶基因ZWF1后，釀酒酵母可以在高濃度的糠醛下生長，這可能是因為過表達(dá)ZWF1使得葡萄糖-6-磷酸脫氫酶的活性增加，為糠醛還原酶或依賴NADPH的脅迫應(yīng)激酶類提供了更多的還原動力(NADPH)，進(jìn)而提高了菌體耐受性。目前為止，所得到的各種抑制物耐受菌大多是通過馴化或者傳統(tǒng)誘變篩選得到的。由于抑制物對于宿主細(xì)胞的抑制機(jī)理還不明確，很難通過定向設(shè)計獲得具有高耐受性的菌種。因此，深入了解水解液中抑制物與細(xì)胞的相互作用關(guān)系，揭示細(xì)胞的脫毒機(jī)制，進(jìn)而定向改造菌株，是當(dāng)前代謝工程亟待解決的問題。

2新型抑制物解除工藝傳統(tǒng)預(yù)處理方法

[29-31]、菌種改造[24]等方法，對于突破木質(zhì)纖維素抑制物瓶頸、實現(xiàn)木質(zhì)素產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)是必不可少的[32]。但它們只專注于單一的技術(shù)突破，忽略了木質(zhì)纖維素本身所具有的結(jié)構(gòu)特點[33]。實際上，木質(zhì)纖維素獨特的組成特點，可以為我們提供新的研究思路[34]；基于此，陳洪章課題組提出了“源頭降低抑制物——纖維素木質(zhì)素分級轉(zhuǎn)化”煉制模式，為木質(zhì)纖維素的開發(fā)和利用，探索出了一條全新的工藝路線；并在此基礎(chǔ)上，進(jìn)一步提出了“原位脫毒——發(fā)酵促進(jìn)劑設(shè)計技術(shù)”，它們共同組成了當(dāng)前最新型的抑制物解除工藝。

2.1源頭降低木質(zhì)纖維素抑制物的分級轉(zhuǎn)化煉制工藝木質(zhì)纖維素原料具有結(jié)構(gòu)復(fù)雜、不均一的多級結(jié)構(gòu)。從細(xì)胞組成上，可以分為纖維狀的纖維細(xì)胞和雜細(xì)胞(包括導(dǎo)管、薄壁細(xì)胞、表皮細(xì)胞等)。纖維細(xì)胞木質(zhì)素含量較高，具有較發(fā)達(dá)的次生壁，因此厚度較大。薄壁細(xì)胞腔大、壁薄、長度短，其成分主要為纖維素[35]。由于結(jié)構(gòu)和形態(tài)上的差異，這兩類細(xì)胞所要求的預(yù)處理條件也是不同的[21]。纖維細(xì)胞，細(xì)胞壁木質(zhì)化程度高，結(jié)構(gòu)致密，受熱過程中傳質(zhì)熱阻力大，且不易被撕裂；薄壁細(xì)胞，壁薄而腔大，即有利于傳質(zhì)傳熱，有利于水蒸氣閃蒸對其物理撕裂。因此，針對不同組織細(xì)胞分別優(yōu)化處理條件，開發(fā)出了二段汽爆分梳技術(shù)。其具體的工藝過程如下：1)將汽爆壓力控制在0.5−1.0MPa、維壓1−10min，對秸稈原料進(jìn)行第一段蒸汽爆破處理。2)通過氣流分級裝置，將第一段汽爆物料進(jìn)行分級，得到薄壁組織和纖維組織。薄壁組織可以直接用于纖維素發(fā)酵。3)將分梳得到的纖維組織在壓力為1−1.5MPa、維壓時間為1−10min條件下進(jìn)行二段蒸汽爆破處理。二段汽爆分梳工藝，不同于傳統(tǒng)所指的二段汽爆工藝，前者采用較溫和的汽爆條件進(jìn)行第一段汽爆，通過氣流分梳裝置將第一段物料(薄壁細(xì)胞)分級，得到薄壁組織和纖維組織，再將纖維組織在適當(dāng)?shù)臈l件下進(jìn)行第二段汽爆。該工藝可以實現(xiàn)纖維素組分的有效分離，即能保證纖維組織達(dá)到較好的預(yù)處理效果，提高纖維原料的酶解效果，又能避免薄壁細(xì)胞的過度降解，從源頭控制了抑制物的產(chǎn)生，減少了脫毒單元操作的引入，簡化了工藝。在二段汽爆以后，將汽爆后的秸稈渣送入1.2m3酸水解罐中，同時加入0.3%−0.5%的稀硫酸，物料和稀硫酸的體積比控制在1∶5−1∶7，在110−120℃的溫度下水解0.5−1.0h，然后利用螺旋擠壓機(jī)將水解液中的液體和固體分開，分別得到水解液和水解渣。水解液主要成分為非半纖維素，水解渣中主要為木質(zhì)素和纖維素。繼而采用2%的堿液提取殘渣中的木質(zhì)素，提取率可達(dá)96%，隨后利用逐級酸性沉淀(pH5−2)分級木質(zhì)素的方法，可以制得小于6kDa，6−10kDa，10−20kDa和大于20kDa等不同分子量范圍的木質(zhì)素，用于不同功能原料的開發(fā)。本課題組的研究發(fā)現(xiàn)，汽爆秸稈酶解液中并不存在糠醛、5-羥甲基糠醛與乙酸的抑制問題，而汽爆秸稈木質(zhì)素降解物才是抑制丁醇發(fā)酵的主要原因[36]。由于從源頭去除了木質(zhì)素對于半纖維素和纖維素發(fā)酵的干擾，發(fā)酵液中的抑制物種類較少，濃度較低，經(jīng)過簡單脫毒(5%−10%的活性炭吸附室溫下處理8−12h)，即可用于正常的丁醇發(fā)酵。基于以上重大技術(shù)突破，組建出與其技術(shù)相配套的自主加工的工業(yè)化裝置系統(tǒng)，完成了年產(chǎn)600t秸稈丁醇中試實驗。所建立的技術(shù)工藝在中國吉林省松原市成功用于“30萬t/年秸稈煉制”產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)。該生產(chǎn)線將為秸稈作為工業(yè)原料生產(chǎn)能源、材料和化學(xué)品提供新的思路和產(chǎn)業(yè)化示范。該工藝有以下幾個特點：1)可以從源頭降低抑制物的產(chǎn)生，簡化了操作工序，降低了預(yù)處理的成本。2)通過組分分離，保證了發(fā)酵底物的純度，提高了溶質(zhì)的傳質(zhì)速率和酶的接觸面積，提高了發(fā)酵效率。3)實現(xiàn)了秸稈全組分高價化經(jīng)濟(jì)全利用，通過經(jīng)濟(jì)分?jǐn)偅黾恿四举|(zhì)纖維素的經(jīng)濟(jì)競爭力。本實驗室所提出的“源頭降低抑制物——纖維素木質(zhì)素分級轉(zhuǎn)化”煉制模式，為木質(zhì)纖維素發(fā)酵抑制物的解除及木質(zhì)纖維素開發(fā)利用提供了全新的技術(shù)路線。

2.2基于木質(zhì)纖維素發(fā)酵特點的過程強(qiáng)化工藝從發(fā)酵微生物本身出發(fā)，通過增加發(fā)酵液中特殊的物質(zhì)，來提高微生物細(xì)胞對抑制物的耐受能力；或者選育出能夠耐受木質(zhì)纖維素水解液中各種抑制物，并具有較高發(fā)酵性能的微生物，以達(dá)到脫毒的目的，這種方法通常被稱為抑制物的原位脫毒。在木質(zhì)纖維素發(fā)酵過程中，往往微量級別(mg/L)的“特殊物質(zhì)”，就可以實現(xiàn)目標(biāo)產(chǎn)物發(fā)酵效率的成倍增長，具有巨大的開發(fā)價值。這些“特殊物質(zhì)”稱為發(fā)酵促進(jìn)劑，大多數(shù)屬于電子穿梭化合物，即具有多種氧化態(tài)和還原態(tài)的物質(zhì)。它們在細(xì)菌代謝過程中扮演著重要的角色。外源添加這種電子穿梭化合物，可以改變胞內(nèi)的電子流向，提高電子傳遞速率，進(jìn)而理性調(diào)控生物胞內(nèi)的能量狀態(tài)和生理狀態(tài)，提高菌體的耐受性和目標(biāo)產(chǎn)物的合成能力。常見的電子穿梭化合物，包括中性紅、亞甲基藍(lán)、聯(lián)芐吡啶、二磺酸蒽醌、Fe(OH)3和甲基紫精等。二磺酸蒽醌常用作腐殖酸的類似物，用于研究醌類物質(zhì)在電子傳遞中的作用。外源添加還原性的二黃酸蒽醌可以改變Clostridiumbeijerinckii的代謝模式，提高H2的產(chǎn)量。Fe(OH)3是最常用的氫氧化物，在厭氧發(fā)酵中是良好的電子載體；甲基紫精同鐵氧化還原蛋白的電勢相似，可以參與一系列生化反應(yīng)過程中的電子傳遞過程，通過鐵氧化還原蛋白-NAD還原酶增強(qiáng)NAD(P)+的電子流。1979年，Hongo等[37]首次提出了“電子能方法”(Electroenergizing)的概念，他們向黃色短桿菌Brevibacteriumflavum菌發(fā)酵液中添加中性紅(電子載體)，發(fā)現(xiàn)谷氨酸的產(chǎn)量明顯提高，而且從陰極傳遞的電子幾乎全部被宿主細(xì)胞吸收。遺憾的是，他們并沒有深入研究這些電子如何進(jìn)入生化代謝途徑。Yarlagadda等[38]通過外源添加甲基紫精，使得Clostridiumsp.BC1的乙醇和丁醇產(chǎn)量分別提高了28倍和12倍，同時菌體對于丁醇等物質(zhì)的耐受性明顯提升。Liu等[39]認(rèn)為這些物質(zhì)與胞內(nèi)的NADPH/NADP+和NADH/NAD+總比例有著直接的聯(lián)系，NADPH/NADP+和NADH/NAD+總比例是主導(dǎo)胞內(nèi)代謝狀態(tài)的最主要因素。生物信息數(shù)據(jù)庫KEGG中包括855和1064個氧化還原反應(yīng)，分別有106和88種以NAD+和NADP+為輔因子的酶催化反應(yīng)(到2012年10月為止)，幾乎涉及所有細(xì)胞骨架類化合物的構(gòu)建(如氨基酸、脂類和核酸)。通過改變胞內(nèi)NADH的水平可以實現(xiàn)胞內(nèi)代謝流的調(diào)控，提高目標(biāo)產(chǎn)物的產(chǎn)量，增強(qiáng)菌體的抑制物耐受性。遺憾的是，目前對于發(fā)酵促進(jìn)劑的研究，主要集中于抑制物耐受機(jī)理的闡明，實驗過程中多采用合成培養(yǎng)基，而實際生產(chǎn)方面的應(yīng)用幾乎沒有開展。基于此，我們率先開展了電子載體物質(zhì)、氧化還原物質(zhì)與木質(zhì)纖維素抑制物原位脫毒關(guān)聯(lián)性的研究，利用秸稈水解液進(jìn)行了實驗驗證，取得了良好的發(fā)酵結(jié)果；首次提出了“發(fā)酵促進(jìn)劑設(shè)計技術(shù)”理念，綜合運用前體工程、理論化學(xué)、計算化學(xué)和計算機(jī)輔助模擬等手段，構(gòu)建出促進(jìn)劑開發(fā)平臺技術(shù)，為傳統(tǒng)的發(fā)酵工藝提出了新的研究思路。其主要內(nèi)容為：首先，運用組合化學(xué)手段，對已有的發(fā)酵促進(jìn)劑進(jìn)行歸類分析，獲取其決定作用的“母核”，然后運用虛擬組合庫進(jìn)行大通量篩選。虛擬組合庫主要出自3個來源：一種是基于分子片段的直接枚舉而產(chǎn)生的新的分子庫；一種是基于反合成分析原理的片段化及重組而產(chǎn)生的新分子庫；另一種是基于分子構(gòu)象疊合和遺傳算法中的雜交原理的分子重組而產(chǎn)生的新的分子。目前，已經(jīng)成功完成了系列產(chǎn)品的研發(fā)，即將進(jìn)行實際發(fā)酵的生產(chǎn)驗證。

3展望

發(fā)酵抑制物制約著木質(zhì)纖維素的發(fā)酵效率，是木質(zhì)纖維素生物煉制的主要瓶頸。現(xiàn)有的物理法、化學(xué)法、生物法等方法，只適用于特定抑制物的去除，而且投入成本較高，難以實現(xiàn)木質(zhì)纖維素的大規(guī)模發(fā)酵。隨著抑制物耐受機(jī)理研究的日益深入和以合成生物學(xué)為代表的菌種改造技術(shù)的成熟，抑制物耐受菌株的理性構(gòu)建將成為可能，同時發(fā)展“高效、清潔、低成本”的抑制物解除工藝，必將助力于木質(zhì)纖維素的大規(guī)模生產(chǎn)。筆者認(rèn)為，充分結(jié)合原料的結(jié)構(gòu)特點，發(fā)展“分級轉(zhuǎn)化”煉制模式，從源頭降低抑制物的產(chǎn)生，將是今后木質(zhì)纖維原料預(yù)處理的發(fā)展趨勢。“分級轉(zhuǎn)化”煉制模式為木質(zhì)纖維素的產(chǎn)業(yè)化提供了全新的思路和工藝“范本”，將對生物質(zhì)煉制產(chǎn)業(yè)的發(fā)展起到推動作用。

作者：王嵐夏夢雷陳洪章單位：中國科學(xué)院過程工程研究所生物質(zhì)煉制工程北京市重點實驗室