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《生物工程學(xué)報(bào)雜志》2014年第六期

1材料與方法

1.1材料與試劑蛋清溶菌酶(HeneggwhiteLysozyme)購(gòu)自Sigma公司；陽離子交換凝膠介質(zhì)(SPSepharoseFF)購(gòu)自GEHealthcare公司；其他所用試劑均為分析純。

1.2核磁共振波譜儀及參數(shù)600M核磁共振波譜儀(BrukerAscend-600AvanceIII)，TCI三共振反式超低溫探頭。一維核磁共振氫譜(1H-NMR)采用的脈沖程序?yàn)閚oesygppr1d，采樣16次；二維氫氫全相關(guān)譜(2D-1H-1HTOCSY)采用的脈沖程序?yàn)閐ipsi2gpph19，采樣24次；采樣前進(jìn)行90°脈沖校準(zhǔn)以及水峰的壓制。

1.3吸附蛋白的氫氘交換標(biāo)記蛋白在陽離子交換介質(zhì)上的吸附以及標(biāo)記路線如圖1。首先，陽離子交換介質(zhì)SPSepharoseFF裝填成柱體積為1mL的色譜柱，用起始緩沖液(20mmol/LPBS,pH7.0)平衡色譜柱；然后，蛋白質(zhì)溶解到起始緩沖液配成0.21mmol/L溶液，進(jìn)樣5ml，緩沖液淋洗并且檢測(cè)紫外吸收值，當(dāng)紫外吸收值為零時(shí)，停止淋洗。其次，用標(biāo)記緩沖液(D2O，20mmol/LPBS，pD7.0)流經(jīng)色譜柱，15min后通入淬滅緩沖液(D2O，20mmol/LNaAC，pD3.0)終止氫氘交換反應(yīng)。最后，已經(jīng)標(biāo)記完之后的蛋白用洗脫液(D2O，20mmol/LNaAC，1mol/LNaCl,pD3.0)洗脫，所獲的標(biāo)記蛋白用3kDa的超濾膜脫鹽凍干之后核磁共振檢測(cè)。對(duì)照組樣品(沒有吸附的蛋白)的做法和上述步驟相似，除去不添加吸附陽離子交換介質(zhì)以及洗脫液。

1.4氫氘交換數(shù)據(jù)分析溶菌酶氨基酸殘基核磁共振信號(hào)根據(jù)與α位碳相連的酰胺氫(NH-CαH)來歸屬，并以文獻(xiàn)報(bào)道結(jié)合生物大分子核磁共振數(shù)據(jù)庫(kù)BiologicalMagneticResonanceBank(BMRB4562)為參考。峰強(qiáng)度(I)通過軟件Topspinversion3.0標(biāo)定。為了排除樣品濃度的影響，以不發(fā)生氫氘交換的芳香族氨基酸Trp108的H4-H5相關(guān)峰為參考峰，對(duì)特征殘基峰的強(qiáng)度進(jìn)行歸一化處理，如式(1)：式中Ipeak為殘基峰的強(qiáng)度；Ireference為參考峰的強(qiáng)度；Inomalize為歸一化后的峰強(qiáng)度。通過比較不同狀態(tài)歸一化后蛋白殘基峰強(qiáng)度的變化可以獲取蛋白各個(gè)殘基酰胺氫對(duì)溶劑可及的敏感程度以及酰胺氫被保護(hù)程度等信息[16-17]。1.5溶劑可及表面計(jì)算通過分子模擬軟件Accelrysdiscoverystudio(Accelrys,Inc.SanDiego,USA)計(jì)算蛋白各個(gè)殘基的溶劑可及表面百分比(Solventaccessiblesurfacearea，SASA)。溶菌酶的三維結(jié)構(gòu)來源于蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)庫(kù)(PDBcode:1E8L)，探針半徑為1.4Å。1.6蛋白靜電勢(shì)計(jì)算蛋白質(zhì)靜電勢(shì)采用通用算法程序，利用分子模擬Accelrysdiscoverystudio軟件中Delphi模塊進(jìn)行蛋白靜電勢(shì)的模擬計(jì)算。

2結(jié)果與分析

2.1溶菌酶的氫氘交換特征蛋白質(zhì)氫氘交換技術(shù)是探測(cè)溶液中蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性、折疊動(dòng)力學(xué)和相互作用的重要研究工具，但在蛋白質(zhì)液固界面吸附中應(yīng)用較少。為確定溶菌酶在液固界面研究中的交換條件和可行性，首先考察了溶菌酶的氫氘交換特征，通過測(cè)定溶菌酶在不同狀態(tài)下1D1H-NMR譜及其酰胺氫峰強(qiáng)度隨時(shí)間變化，來評(píng)估蛋白結(jié)構(gòu)對(duì)氫氘交換的敏感性以及交換反應(yīng)的合理時(shí)間。結(jié)果如圖2所示，測(cè)定了溶菌酶在天然態(tài)(90%H2O/10%D2O，pH7.0，25℃)和變性態(tài)(60%ACN/40%D2O，pH7.0，25℃)不同時(shí)間間隔點(diǎn)的一維核磁共振氫譜(1D1H-NMR)。其中，由于1D氫譜中大部分殘基的譜峰疊加，單獨(dú)選取了譜峰清晰分辨率較高的W123、W111、W63和W108四個(gè)代表殘基來觀察溶菌酶在天然態(tài)和變性態(tài)的動(dòng)力學(xué)變化。天然態(tài)(圖2，A-1、A-2)顯示，4個(gè)殘基的酰胺氫峰強(qiáng)度在開始10min內(nèi)快速下降，在20min到180min時(shí)則下降趨緩。對(duì)比變性態(tài)(圖2B-1、B-2)，溶菌酶酰胺氫不但化學(xué)位移有顯著變化，并且4個(gè)殘基的峰強(qiáng)在更短時(shí)間約5min內(nèi)降到最低。這反映出天然態(tài)溶菌酶能夠保持緊密三維球形狀態(tài)，氘離子較難到達(dá)處于蛋白內(nèi)部的殘基區(qū)域，氫氘交換速率及峰強(qiáng)下降比較緩慢；而在變性劑乙腈溶液中，蛋白結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，致使個(gè)別殘基峰周圍的電子云環(huán)境改變而造成化學(xué)位移改變，并且由于蛋白去折疊，溶劑中的氘離子很容易到達(dá)去折疊的酰胺區(qū)域發(fā)生氘代反應(yīng)，峰強(qiáng)下降且很快達(dá)到平衡。以上現(xiàn)象表明溶菌酶的結(jié)構(gòu)變化對(duì)氫氘交換反應(yīng)非常敏感，蛋白的去折疊程度可由其評(píng)估。此外氫氘交換在天然態(tài)和變性態(tài)下達(dá)到平衡的時(shí)間分別是10min和5min，因此在后續(xù)實(shí)驗(yàn)中蛋白在陽離子交換介質(zhì)上吸附交換時(shí)間控制在10min以上。

2.2溶菌酶在陽離子交換介質(zhì)表面的吸附行為由于溶菌酶核磁信號(hào)在一維氫譜上嚴(yán)重重疊無法指認(rèn)各個(gè)殘基。因此本文擬通過二維氫譜中化學(xué)位移全相關(guān)譜TOCSY譜(Totalchemicalshiftcorrelationspectroscopy)來獲得殘基信息。TOCSY譜可以描述在蛋白肽鏈內(nèi)具有α-H、β-H間偶極偶合相關(guān)的氫信號(hào)，其優(yōu)點(diǎn)是以交叉峰的形式指認(rèn)各個(gè)殘基，譜峰很少重疊、分辨率較高。利用該技術(shù)，本文繼續(xù)考察了溶菌酶在陽離子交換介質(zhì)表面的吸附行為，根據(jù)各殘基峰強(qiáng)度可以獲知溶菌酶上氫質(zhì)子被氘取代的程度，從而判斷出蛋白質(zhì)的去折疊程度。在以上溶液實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，。對(duì)比吸附態(tài)與天然態(tài)溶菌酶的TOCSY譜(圖3)，顯示吸附態(tài)時(shí)溶菌酶殘基酰胺氫信號(hào)的丟失要多于天然態(tài)。說明吸附到陽離子交換介質(zhì)上的溶菌酶暴露出更多的殘基在重水溶劑里；同時(shí)，也說明溶菌酶緊密的球狀蛋白開始松解，由此可推測(cè)陽離子交換介質(zhì)表面的靜電基團(tuán)是介導(dǎo)溶菌酶去折疊行為的主要機(jī)制。為詳細(xì)了解溶菌酶蛋白各區(qū)域在陽離子交換介質(zhì)表面的去折疊行為，對(duì)各個(gè)殘基酰胺氫的交聯(lián)峰進(jìn)行歸屬和回歸分析(圖4)。吸附態(tài)和天然態(tài)殘基峰強(qiáng)度對(duì)比顯示，吸附態(tài)殘基峰強(qiáng)度明顯比天然態(tài)殘基弱，說明吸附態(tài)暴露出更多殘基在溶液中。但是，絕大部分的殘基信號(hào)保留下來，說明溶菌酶的結(jié)構(gòu)只是發(fā)生局部去折疊，例如一些二級(jí)結(jié)構(gòu)α-helix、β-sheet(H1、H2、H3、H4、H5、H6、S2，S1除外)能夠保持其原有結(jié)構(gòu)。此外，不同的結(jié)構(gòu)片段呈現(xiàn)出不同的氫信號(hào)保護(hù)程度，一些無規(guī)則卷曲(Coil，bend，andturn)片段的氫信號(hào)就更容易失去(如69-75、80-95和115-120)，相反，二級(jí)結(jié)構(gòu)域?qū)涞男盘?hào)保護(hù)則更好。以上研究表面，吸附態(tài)溶菌酶無規(guī)則片段去折疊程度更大，而二級(jí)結(jié)構(gòu)域受到保護(hù)。這種由靜電作用介導(dǎo)的蛋白質(zhì)去折疊與由疏水作用和變性劑介導(dǎo)的去折疊區(qū)域有許多相似之處,如二級(jí)結(jié)構(gòu)被保護(hù)，無規(guī)則結(jié)構(gòu)去折疊等。但去折疊程度明顯不同，對(duì)比本課題組研究溶菌酶在苯基瓊脂糖疏水介質(zhì)表面的去折疊發(fā)現(xiàn)，靜電配基介導(dǎo)的溶菌酶殘基信號(hào)損失要明顯少于后者，這說明靜電作用導(dǎo)致的蛋白去折疊要弱于疏水作用對(duì)蛋白的破壞程度。

2.3溶菌酶與陽離子交換介質(zhì)的作用位點(diǎn)分析詳細(xì)了解蛋白質(zhì)分子與介質(zhì)相互作用中起決定作用的綁定位點(diǎn)，對(duì)于深刻理解層析過程中蛋白質(zhì)與層析介質(zhì)微觀作用機(jī)理以及吸附劑的選擇、設(shè)計(jì)具有重要意義。離子交換色譜利用蛋白質(zhì)與離子交換介質(zhì)之間的靜電作用力的不同達(dá)到分離純化。對(duì)于陽離子交換介質(zhì)，由于帶負(fù)電荷，主要由蛋白表面帶正電荷的氨基酸與其發(fā)生靜電作用。此外，研究者利用核磁共振檢測(cè)到蛋白質(zhì)與固體介質(zhì)的作用界面的殘基酰胺氫信號(hào)保護(hù)程度大于溶液中殘基。因此，可以確定蛋白與陽離子交換介質(zhì)的作用位點(diǎn)主要有3個(gè)特征：1)帶正電荷的氨基酸；2)蛋白表層的氨基酸；3)接觸面酰胺氫信號(hào)被保護(hù)的氨基酸。本研究擬依據(jù)這3個(gè)特征確定溶菌酶與陽離子交換介質(zhì)的結(jié)合位點(diǎn)。首先，為確定蛋白表層帶正電荷的氨基酸殘基，通過計(jì)算機(jī)分子模擬計(jì)算軟件(Accelrysdiscoverystudio)里的Delphi模塊計(jì)算出每個(gè)殘基的平均凈電勢(shì)，篩選出平均靜電勢(shì)大于零為帶正電荷的氨基酸殘基，然后，再?gòu)闹泻Y選出SASA大于10%的殘基,SASA大于10%的殘基被認(rèn)為是溶劑可及殘基(圖5)。

其次，通過公式(2)篩選出被接觸面保護(hù)的氨基酸。其中，I%為吸附前后蛋白的強(qiáng)度損失程度，當(dāng)I%值大于零時(shí)即為酰胺氫信號(hào)被保護(hù)的殘基，如圖6A。圖6B為溶菌酶的氨基序列，其中被接觸面保護(hù)的殘基以斜體下劃線標(biāo)出，盡管這些氨基酸殘基序列并不依次相連，但在蛋白三維結(jié)構(gòu)中，大部分殘基在同一表面。最終，取帶正電荷的表層氨基酸與氫信號(hào)被保護(hù)的氨基酸之間的交集，篩選出溶菌酶與陽離子交換介質(zhì)的作用位點(diǎn)分別為L(zhǎng)ys33、Arg114、Arg68(圖7)，這與研究者用熒光標(biāo)記賴氨酸測(cè)定的溶菌酶與相同陽離子交換介質(zhì)(即SPSepharoseFF)的作用位點(diǎn)Lys33一致。但由于熒光標(biāo)記法只能標(biāo)記賴氨酸一種帶正電荷的殘基，僅獲得了賴氨酸的綁定信息。此外，另一類常用技術(shù)是通過比較定點(diǎn)突變蛋白的保留時(shí)間差異來判斷介質(zhì)表面的綁定位點(diǎn)[5,28-29]，由于需要復(fù)雜的基因工程技術(shù)來構(gòu)建蛋白質(zhì)突變株，這些方法普遍存在如下問題：1)尋找存在突變株的蛋白較為困難，導(dǎo)致可研究的蛋白種類非常有限；2)沒有考慮當(dāng)引入兩個(gè)或多個(gè)取代殘基時(shí)蛋白三維結(jié)構(gòu)改變對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的影響。相比而言，本研究利用H/D交換結(jié)合核磁共振技術(shù)，能夠彌補(bǔ)上述缺陷可獲得所有殘基包括帶同樣正電荷的精氨酸和組氨酸等的作用信息，并實(shí)現(xiàn)了原位標(biāo)記、實(shí)時(shí)、快速的表征介質(zhì)表面各種蛋白去折疊程度的信息。

3結(jié)論

本研究利用氫氘交換結(jié)合NMR技術(shù)表征了蛋白在離子交換介質(zhì)上的吸附過程。結(jié)果顯示，當(dāng)溶菌酶吸附到介質(zhì)表面之后，不同結(jié)構(gòu)片段的去折疊程度不同，無規(guī)則卷曲(Coil，bend，andturn)片段酰胺氫信號(hào)更易失去即去折疊明顯，二級(jí)結(jié)構(gòu)域(α-helix，β-sheet)對(duì)酰胺氫信號(hào)保護(hù)較好即去折疊較弱，表明靜電介導(dǎo)的蛋白去折疊呈局部分布。通過蛋白表面靜電勢(shì)模擬計(jì)算結(jié)合氫氘標(biāo)記的蛋白核核磁數(shù)據(jù)分析確定了溶菌酶與陽離子交換介質(zhì)的作用位點(diǎn)為L(zhǎng)ys33、Arg114、Arg68。本研究提供了一條原位實(shí)時(shí)捕捉多孔介質(zhì)內(nèi)的蛋白結(jié)構(gòu)變化信息的新途徑，對(duì)于深刻理解層析過程中蛋白與層析介質(zhì)微觀作用機(jī)理具有重要意義，也為其他領(lǐng)域中蛋白質(zhì)與生物材料之間微觀界面研究提供了新的技術(shù)手段。

作者：王康郝冬霞齊樹亭馬光輝單位：河北工業(yè)大學(xué)海洋科學(xué)與工程學(xué)院中國(guó)科學(xué)院過程工程研究所生化工程國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室