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作者：劉長發(fā)姚敬元袁瑗劉衛(wèi)東單位：近岸海洋環(huán)境科學與技術(shù)遼寧省高校重點實驗室大連海洋大學大連海洋大學海洋科技與環(huán)境學院遼寧省海洋水產(chǎn)科學研究院

材料與方法

1材料

氨氧化細菌樣品采自實驗室規(guī)模的封閉循環(huán)海水養(yǎng)殖系統(tǒng)中填充塑料環(huán)載體的硝化作用濾器。采樣前14d測得的硝化作用濾器的性能指標見表1。

2基因組RNA的提取

將適量附有生物膜的載體置于盛有150mL滅菌海水的250mL燒杯中，用磁力攪拌器攪拌。20min后采用2種方法濃縮菌體:一是過濾，用0．45μm微孔濾膜過濾、蒸餾水沖洗后置于－20℃?zhèn)溆?二是離心(HERMLZ323K，德國)，4℃下12000r/min離心5min，收集離心沉淀物備用。RNA提取采用經(jīng)典方法的改進方法。于收集的菌體中加入6μL20mg/mL蛋白酶K、2μL0．2%β-巰基乙醇、0．6mL2%CTAB(十六烷基三甲基溴化銨)，55℃溫育1h后消化，再加入酚-氯仿-異戊醇(25∶24∶1)混合液，完全混勻后，12000r/min離心5min。取上清于一潔凈離心管中，再加入氯仿-異戊醇(24∶1)混合液混勻后12000r/min離心5min。再取上清于潔凈離心管中，加入雙倍量的無水乙醇，混勻后置于－20℃下20min。高速離心產(chǎn)物以70%乙醇洗2遍之后風干。加入適量TE后置于－20℃保存待用。

3相關(guān)基因的PCR擴增

以提取的基因組RNA作為PCR反應(yīng)模板，采用巢式擴增法對氨氧化細菌16SrRNA基因及氨單加氧酶基因amoA進行PCR擴增(Eppen-dorfS，德國)。具體方法是:先采用細菌16SrRNA基因通用引物11f和1492r(表2)進行大量擴增，之后再以特異性引物Nso1225和通用引物［18］EUB338對β-亞類氨氧化細菌進行擴增;還采用氨氧化細菌amoA基因特異性引物AmoA-1F和AmoA-2R對通用引物的PCR產(chǎn)物進行二次擴增。

4酶切連接

16SrRNA基因擴增片段的限制性酶切體系為2μLPCR產(chǎn)物，1μL緩沖液，1μL0．1%BSA及0．5μLTaqI內(nèi)切酶，在65℃下溫育4h進行酶切;amoA的限制性酶切體系為2μLPCR產(chǎn)物、1μL緩沖液、1μL0．1%BSA及0．5μLMspI內(nèi)切酶，在37℃溫育3h進行酶切。酶切后以接頭引物在22℃下連接6h。在之后的PCR反應(yīng)中，以接頭引物與相應(yīng)的RNA一端引物配對，使之只能擴增出一端的末端片段。

5溶膠液PCR

將1．4節(jié)中的PCR產(chǎn)物進行4．5%聚丙烯酰胺凝膠電泳，電泳后膠板在空氣中干燥約1h，用潔凈的小刀將產(chǎn)物帶割下，溶于純凈水1h，以6μL溶液作為模板進行PCR擴增。16SrRNA的引物為接頭引物(TaqI)和末端引物(Nso1225或Eub338f)雙引物;氨氧化細菌amoA引物接頭引物(MspI)和末端引物(AmoA-1F或AmoA-2R)雙引物。

6克隆測序、序列對比分析與系統(tǒng)發(fā)育分析

將得到的末端片段PCR產(chǎn)物送交寶生物工程(大連)有限公司進行克隆測序。測得序列在GenBank中進行BLAST(blast．ncbi．nlm．nih．gov/)搜索，尋同源已知菌，并采用ClustalX及MEGA3軟件進行系統(tǒng)發(fā)育分析。

結(jié)果

1PCR片斷酶切及擴增產(chǎn)物

圖1為氨氧化細菌16SrRNA酶切片段及PCR產(chǎn)物電泳圖。其中，左側(cè)泳道為100bpRNAladderMarker，1、2泳道為酶切片段，為使酶切片段能更清晰的在電泳圖上表現(xiàn)出來，采取了增加模板量的方法，雖然可能一些模板不被切開，但在連接液中使用的酶切液含模板較少，未切開的模版對結(jié)果影響很小。3、4、5泳道為引物TaqI+Nso1225的PCR產(chǎn)物，在10μL反應(yīng)液中的模板濃度分別為0．125μL、0．25μL、0．5μL，結(jié)果是條帶單一且均很亮;6、7、8泳道為引物TaqI+EUB338的組合PCR產(chǎn)物，在10μL反應(yīng)液中的圖1氨氧化細菌16SrRNA酶切片段及擴增產(chǎn)物電泳圖Fig．1GelosegelprofileofAOB16SrRNAgenesequencesandPCR-amplifiedproducts模板濃度分別為0．125μL、0．25μL、0．5μL。由圖1，引物TaqI+EUB338組合的PCR產(chǎn)物有多個清晰的條帶，多態(tài)性明顯高于引物TaqI+Nso1225的PCR產(chǎn)物。可選擇引物TaqI+EUB338組合的PCR產(chǎn)物作為割膠擴增的模板。

2溶膠液PCR產(chǎn)物電泳

圖2為引物TaqI+EUB338組合的氨氧化細菌16SrRNA正向末端酶切片段溶膠液PCR擴增產(chǎn)物電泳圖。圖中左側(cè)泳道為100bpRNAladderMarker，奇數(shù)道為僅使用雙倍量TaqI接頭引物(0．4μL/10μL)的單引物即擴增產(chǎn)物，偶數(shù)道為使用TaqI接頭引物(0．2μL/10μL)+EUB338組合引物的擴增產(chǎn)物。由圖2可見，奇數(shù)道無條帶，表明在單引物實驗體系中無擴增產(chǎn)物，偶數(shù)道即在雙引物實驗體系中有擴增產(chǎn)物，且條帶清晰、無拖尾，片段長度不同均在300bp以下，可用于基因克隆測序。圖3為氨氧化細菌amoA正向末端酶切片段溶膠液PCR擴增產(chǎn)物電泳圖。圖中左側(cè)泳道為100bpRNAladderMarker，其它泳道為amoA基因條帶，均集中于100～200bp，長度接近，清晰無拖尾，PCR效果良好，可用于基因克隆測序。

3基因序列測定及系統(tǒng)發(fā)育樹分析

對氨氧化細菌16SrRNA和amoA基因正向末端酶切片段溶膠液PCR擴增產(chǎn)物進行測序，共測得11條序列，其長度分布于200～300bp，16SrRNA基因序列的Blast分析結(jié)果見表3所示，amoA基因序列Blast分析結(jié)果見表4所示。序列11-8、11-8-1-2、11-8-2-2及序列10-6-1與亞硝化單胞菌群中Nitrosomonasoligotropha(EF016119、AJ298736)的相似度≥99%，可確定為同一屬;序列35、36、37及11-8-7-2與亞硝化單胞菌屬Nitrosomonassp．(AF386746、M96400、AY123811、DQ002459)的相似度為95%以上;序列2與Nitrosomonasaestuarii(AF272420)、序列4-26-1-4-1與Nitrosomonasmarina(AF272418)的相似度分別為100%，基本確定為同一種，屬于亞硝化單胞菌群。僅有與Nitrosospiratenuis(AJ298746)的相似度為100%的序列10-6-3屬于亞硝化螺菌屬。由此可推斷，在循環(huán)海水養(yǎng)殖系統(tǒng)硝化作用濾器氨氧化細菌中亞硝化單胞菌群占主體，存在少量的亞硝化螺菌群。圖4為氨氧化細菌16SrRNA序列同源性分析圖。由表4，對氨氧化細菌amoA正向末端酶切片段溶膠液PCR擴增產(chǎn)物進行測序，只測得3條序列，其長度在200～300bp。序列11-8-12、11-8-13與Nitrosomonassp．(AF386746、AF339041)相似度分別為87%和92%;序列9-26-4-1-2與Nitro-somonascryotolerans(AF314753)的相似度為87%。

相似度都不高，均屬于亞硝化單胞菌群。由于測得的序列信息量相對較少，故未作聚類分析。

討論

硝化作用過程一般包括兩個轉(zhuǎn)化步驟，第一步是氨氧化為亞硝酸(NH+4→NO－2)，第二步是亞硝酸氧化為硝酸(NO－2→NO－3)，其中第一步是限制性步驟。該步驟對氨氮轉(zhuǎn)化為硝酸氮即對氨氮的去除有著很大影響。因此，分析循環(huán)海水養(yǎng)殖系統(tǒng)硝化作用濾器載體上附著的氨氧化微生物，對于明確硝化作用濾器的掛膜及生物膜對氨氮的去除有重要意義。

基于16SrRNA基因序列同源性系統(tǒng)發(fā)育分析結(jié)果表明，氨氧化細菌系統(tǒng)發(fā)育較單一，均屬于變形菌門(Proteobacteria)的β-變形菌綱和γ-變形菌綱。其中β-變形菌綱又分為2個類群:亞硝化單胞菌(Nitrosomonas)和亞硝化螺菌(Nitrosospi-ra)。基于16SrRNA的AFLP技術(shù)中使用巢式PCR在分析亞硝化單胞菌上具有高度的靈敏性和有效性。本實驗采用氨氧化細菌16SrRNA基因特異PCR結(jié)合改良的擴增片段長度多態(tài)性(AFLP)方法，所測得的11條序列經(jīng)Blast分析，大部分序列與亞硝化單胞菌群Nitrosomonasoligo-tropha、Nitrosomonasmarina及Nitrosomonasaesturii等序列相似度高，推斷在生物濾器中有大量亞硝化單胞菌群存在;也有少數(shù)序列(10-6-3)與亞硝化螺菌群序列相似度高，推斷在生物濾器中可能存在少量的亞硝化螺菌;還有一些序列經(jīng)Blast分析發(fā)現(xiàn)其與埃希式桿菌屬(GQ149348)具有一定的相似性，表明該硝化作用濾器中還可能存在一定數(shù)量的γ-變形菌綱細菌。本次并未檢測到亞硝化葉菌屬、亞硝化球菌屬及亞硝化弧菌屬的類似菌，還有待進一步的實驗驗證。

采用氨單加氧酶功能基因定性分析氨氧化細菌的分子生物學方法主要是分析amoA、amoB和amoC亞基組成的基因產(chǎn)物，其中amoA基因的定性分析可以反映出氨氧化細菌的種類、數(shù)量和活性。對氨氧化細菌的研究表明，鹽分可以明顯影響氨氧化細菌的多樣性，河口區(qū)域氨氧化細菌多樣性的減少與鹽度升高相關(guān)，認為鹽度是氨氧化細菌多樣性和分布的環(huán)境控制因子，高鹽區(qū)域的氨氧化細菌大多數(shù)類似于亞硝化螺菌屬(Ni-trosospira)，而在中低鹽度區(qū)域則分布著類亞硝化螺菌屬(Nitrosospira)序列的氨氧化細菌，以及與Nitrosomonasureae、Nitrosomonasoligotropha和Ni-trosomonassp．Nm143相關(guān)序列的氨氧化細菌。采用氨氧化細菌amoA基因分析循環(huán)海水養(yǎng)殖系統(tǒng)硝化作用濾器載體上的氨氧化細菌得到的信息量相對較少。采用不同的16SrRNA基因序列引物和不同的PCR及電泳方法可能擴增出不同類群的微生物，因此在選擇特異性擴增引物及PCR、電泳方法時，要兼顧擴增效率和擴增多樣性兩個方面。

如采用PCR-DGGE方法分析循環(huán)水養(yǎng)殖系統(tǒng)生物濾池中的細菌主要由擬桿菌門的黃桿菌綱和變形菌門的α-、β-、γ-變形菌綱的15種細菌組成，并且，初始氨氮越高的濾池中，亞硝化單胞菌屬的細菌在生物膜上所占比例越高。Nso1225探針對β-變形菌綱氨氧化細菌具有高度特異性。

CTO189f/CTO654r引物擴增到的β-變形菌綱氨氧化細菌均屬于Nitrosospira，但CTO189f/CTO654r引物難以擴增到Nitrosomonasoligotropha和Nitrosomonascommunis。鑒于不同引物對β-變形菌綱氨氧化細菌的擴增效率不同，可采用多對引物同時擴增目的基因，則可能得到更加全面的β-變形菌綱氨氧化細菌多樣性結(jié)果。鹽分可以明顯影響氨氧化細菌的多樣性，高鹽度環(huán)境下，氨氧化細菌的多樣性明顯減少，但其數(shù)量明顯增加。pH值也是影響氨氧化細菌群落結(jié)構(gòu)的一個主要因素，pH不同，優(yōu)勢菌群也會不同。