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作者：徐洋沈錦玉姚嘉赟潘曉藝郝貴杰尹文林楊國梁王軍毅單位：浙江省淡水水產(chǎn)研究所浙江湖州

人工感染試驗(yàn)

將供試菌株接種于TSB培養(yǎng)液，28℃恒溫培養(yǎng)24h后，用生理鹽水將菌液分別稀釋至108、107、106、105CFU/mL，每個稀釋度注射3個試驗(yàn)組，每個試驗(yàn)組選取30尾體長為10cm的健康羅氏沼蝦成蝦，在靠近尾扇第3腹節(jié)處注射菌液，對照組注射生理鹽水，注射量為0.15mL/尾。養(yǎng)殖用水為健康蝦塘水，水溫(26±2)℃，記錄每天成蝦的死亡情況。

主要致病菌的鑒定

1形態(tài)觀察

觀察致病菌的菌落形態(tài)，亞甲藍(lán)染色觀察細(xì)菌的形態(tài)，革蘭氏染色進(jìn)行鑒別試驗(yàn)。

2生理生化特性測定

根據(jù)革蘭氏染色的結(jié)果選取相應(yīng)的細(xì)菌生化鑒定管進(jìn)行生理生化試驗(yàn)，參照細(xì)菌生化鑒定編碼冊判定結(jié)果。

3PCR鑒定

參照文獻(xiàn)的方法，設(shè)計(jì)針對細(xì)菌16SrRNA基因的特異性引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增。引物由上海英駿生物技術(shù)有限公司合成，序列為P15''''-AGGTTGATGCCTAATACGTA-3''''和P25''''-CGTGCTG-GCAACAAAGGACAG-3''''。用試劑盒提取細(xì)菌的DNA作為模板，PCR反應(yīng)體積為50μL，包括:Buffer(含MgCl2)5μL;DNTP(10mmol/L)4μL;ddH2O38μL;引物(10μmol/L)各1μL;Taq酶0.5μL;細(xì)菌模板0.5μL。反應(yīng)條件:95℃預(yù)變性3min，94℃變性40s，51℃退火40s，72℃延伸90s，共進(jìn)行35個循環(huán)，最后在72℃繼續(xù)延伸8min，將產(chǎn)物送至上海英駿生物技術(shù)有限公司進(jìn)行測序。1.7藥物敏感性試驗(yàn)取適量的細(xì)菌培養(yǎng)液均勻涂布于TSA培養(yǎng)基上，貼上藥敏試紙，恒溫28℃培養(yǎng)24h后測量抑菌圈直徑，并根據(jù)抑菌圈直徑和各種抗菌藥物的具體標(biāo)準(zhǔn)判定其是否敏感。

結(jié)果

1流行病學(xué)調(diào)查結(jié)果

初步統(tǒng)計(jì)2009—2010年長三角地區(qū)羅氏沼蝦成蝦的主要疾病為三大類:肌肉白濁病:具體癥狀為體色發(fā)白，特別是尾扇部有白色斑點(diǎn)(以上海崇明和浙江嘉興病樣為主);藍(lán)體病:具體癥狀為食欲減退，行動遲緩，全身均為深藍(lán)色，肌肉也呈淡藍(lán)色(以江蘇高郵病樣為主);紅體病:具體癥狀為軀體與附肢變紅，腮部變黃且出現(xiàn)大水泡，眼睛凹陷或脫落(以浙江湖州病樣為主)。

2電鏡觀察

病樣電鏡觀察未發(fā)現(xiàn)明顯的病毒樣顆粒。

3病樣與病原菌的分類

用細(xì)菌學(xué)方法從病樣的血液和肝胰腺中分離到優(yōu)勢菌11株，并對11株優(yōu)勢菌進(jìn)行命名，結(jié)合2.1中三類不同的患病癥狀，將所得優(yōu)勢菌進(jìn)行分類，結(jié)果見表1。

4主要致病菌的篩選

根據(jù)11株優(yōu)勢菌人工感染試驗(yàn)結(jié)果(表2)，結(jié)合三類不同的患病癥狀，篩選出死亡率最高的3株細(xì)菌，分別為SHB1、GYB8、HZL2。這3株細(xì)菌人工感染的病蝦癥狀與其分離的病癥相似，且將人工感染的病蝦進(jìn)行細(xì)菌分離能復(fù)制出原始的菌落形態(tài)與細(xì)菌形態(tài)，因此判斷SHB1、GYB8、HZL2為主要致病菌。

5主要致病菌的鑒定

菌落形態(tài)觀察

SHB1在TSA培養(yǎng)基上為灰白色圓形菌落，邊緣光滑、中央凸起，細(xì)菌形態(tài)為短桿狀(圖1)，革蘭氏染色呈紅色，初步判斷為革蘭氏陰性菌;GYB8在TSA培養(yǎng)基上為半透明的突起圓形小菌落，細(xì)菌形態(tài)為直桿狀(圖2)，革蘭氏染色為紅色，初步判斷為腸桿菌科;HZL2在TSA培養(yǎng)基上為白色大菌落，不規(guī)則形態(tài)呈片狀生長，有遷徙生長的特性，細(xì)菌形態(tài)為兩端鈍圓的小桿菌(圖3)，且革蘭氏染色為紅色，初步判斷為變形桿菌屬。

生理生化特性測定

根據(jù)形態(tài)染色的結(jié)果，參照相應(yīng)細(xì)菌生化鑒定編碼冊進(jìn)行生理生化試驗(yàn)，具體結(jié)果見表3。結(jié)果表明:SHB1、GYB8和HZL2依次為氣單胞菌屬(Aeromonas)、費(fèi)氏檸檬酸桿菌(Citrobacterfreun-dii)、普通變形桿菌(Proteusvulgaris)。

PCR鑒定

PCR擴(kuò)增得到與預(yù)期大小相符的DN段(圖4)，其中SHB1的PCR產(chǎn)物共測出1066bp的序列，與嗜水氣單胞菌(Aeromonashydrophila)N2株同源性最高，為100%，因此可確定該細(xì)菌為嗜水氣單胞菌;GYB8的PCR產(chǎn)物共測出1457bp的序列，與費(fèi)氏檸檬酸桿菌HPG143株同源性最高，為100%，因此可確定該細(xì)菌為費(fèi)氏檸檬酸桿菌;HZL2的PCR產(chǎn)物共測出1175bp的序列，與普通變形桿菌SBP10株同源性最高，為95%，因此可確定該細(xì)菌為普通變形桿菌。3株主要致病菌的序列結(jié)果見圖5－7。

6藥物敏感性試驗(yàn)

對SHB1、GYB8和HZL2進(jìn)行常用抗生素的藥物敏感試驗(yàn)，結(jié)果見表4。結(jié)果表明3株主要致病菌對環(huán)丙沙星和恩諾沙星高度敏感。

討論

本研究初步統(tǒng)計(jì)2009—2010年長三角地區(qū)羅氏沼蝦成蝦的主要疾病為三大類:肌肉白濁病、藍(lán)體病和紅體病，且三類疾病有明顯的地域性。目前國內(nèi)梁森漢等對病蝦進(jìn)行了病原分離和回歸感染等試驗(yàn)，認(rèn)為細(xì)菌是羅氏沼蝦肌肉白濁病的病原;姜蘭等從患白濁病的羅氏沼蝦蝦苗病灶分離到多株菌株，其中一株經(jīng)人工感染證實(shí)為病原菌，經(jīng)自動細(xì)菌鑒定儀測試為木糖葡萄球菌(Staphylococcusxylosus);筆者通過病原鑒定發(fā)現(xiàn)本次采集到的肌肉白濁病病樣的主要致病菌是嗜水氣單胞菌，由嗜水氣單胞菌引發(fā)的水生動物暴發(fā)性疾病屢屢發(fā)生，但目前甚少見到嗜水氣單胞菌引起羅氏沼蝦成蝦死亡。藍(lán)體病目前在國內(nèi)外極少見相關(guān)報(bào)道，該病癥在江蘇高郵地區(qū)極為普遍，其主要致病菌是費(fèi)氏檸檬酸桿菌，該病癥表現(xiàn)為肌肉呈淡藍(lán)色，由于蝦的血液為藍(lán)色，考慮費(fèi)氏檸檬酸桿菌是否存在使血液凝集的致病因子。費(fèi)氏檸檬酸桿菌導(dǎo)致水產(chǎn)動物患病死亡的病例較少，李華等首次報(bào)道費(fèi)氏檸檬酸桿菌是河蟹(Eriocheirsinensis)的致病菌，沈錦玉等研究認(rèn)為，費(fèi)氏檸檬酸桿菌是紅螯螯蝦(Cheraxquadricarinatus)的致病菌。紅體病通常都爆發(fā)于仔蝦中，有學(xué)者認(rèn)為是一種由副溶血弧菌感染引起的細(xì)菌病，本研究發(fā)現(xiàn)其主要致病菌為普通變形桿菌，許兵等曾在對蝦上分離到該病原菌，普通變形桿菌易引發(fā)的人類疾病，是人畜共患致病菌之一，因此需加強(qiáng)對該類疫病的檢測，以防危害人類健康。

分離菌株的藥物敏感性試驗(yàn)表明，3種主要致病菌對環(huán)丙沙星和恩諾沙星高度敏感，在生產(chǎn)上使用這兩種藥物也有一定的效果，但由于甲殼類動物構(gòu)造及食性方面的特性［19］，一定程度上阻礙了藥物的吸收，且普通變形桿菌等宿主范圍較廣，在許多生物中均可以感染，屬于人畜共患致病菌之一，因此養(yǎng)殖場不能盲目用藥，以免給整個水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)造成更大的經(jīng)濟(jì)損失。因而，切斷疾病的傳染源、保持養(yǎng)殖環(huán)境的穩(wěn)定性、提高蝦的抗病力，才有利于防治蝦病發(fā)生。