本站小編為你精心準(zhǔn)備了KHV檢驗(yàn)方式及應(yīng)對(duì)舉措?yún)⒖挤段模高@些范文能點(diǎn)燃您思維的火花，激發(fā)您的寫(xiě)作靈感。歡迎深入閱讀并收藏。

作者：孟慶峰錢(qián)愛(ài)東王偉利單位：吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院吉林出入境檢驗(yàn)檢疫局

病原分離鑒定

錦鯉皰疹病毒的分離主要采用細(xì)胞培養(yǎng)分離技術(shù)，此技術(shù)是最準(zhǔn)確的診斷方法，國(guó)際獸疫局(OIE)將其推薦為首選方法。研究表明，錦鯉皰疹病毒具有種屬特異性，只能在原始宿主細(xì)胞上生長(zhǎng)，即只能在錦鯉鰭細(xì)胞(KF)上生長(zhǎng)，并產(chǎn)生特征性病變，錦鯉皰疹病毒的這種特性，可作為一種診斷方法。錦鯉鰭細(xì)胞系是美國(guó)的研究人員在1997年建立起來(lái)的，錦鯉皰疹病毒在錦鯉鰭細(xì)胞上的適宜培養(yǎng)溫度為15～25℃，最適培養(yǎng)溫度為20℃。

P．R．Calle等研究表明，常用的魚(yú)細(xì)胞都很難分離到病毒，錦鯉皰疹病毒只能在錦鯉鰭細(xì)胞、宿主細(xì)胞及魚(yú)腦中增殖，再通過(guò)細(xì)胞培養(yǎng)的方法對(duì)臨床受感染魚(yú)體進(jìn)行病毒分離。劉葒等人的研究也證實(shí)，該病毒不可能在草魚(yú)性腺細(xì)胞系(CO)、鯉魚(yú)上皮細(xì)胞(EPC)和鯉魚(yú)腎(CK)細(xì)胞上生長(zhǎng)。朱霞等將鯉魚(yú)腎細(xì)胞和單層框鏡鯉魚(yú)鰭條細(xì)胞共同培養(yǎng)，培養(yǎng)5～6d后出現(xiàn)典型的細(xì)胞病變，這是國(guó)內(nèi)首次分離到的錦鯉皰疹病毒。然而，能夠分離病毒的細(xì)胞系有其自身的局限性;因此，細(xì)胞培養(yǎng)分離法在檢測(cè)錦鯉皰疹病毒DNA時(shí)并不像PCR方法那樣敏感，不能作為一種可靠的檢測(cè)方法來(lái)進(jìn)行考慮。還有研究表明，從死亡稍長(zhǎng)或冰凍的感染錦鯉組織中很難分離到病毒，若想分離病毒需用新鮮的腎臟做病毒培養(yǎng)，因?yàn)槟I臟是錦鯉皰疹病毒增毒最高的組織。

抗原檢測(cè)

1免疫熒光檢測(cè)

錦鯉皰疹病毒可以通過(guò)肝臟、腎臟及感染魚(yú)類(lèi)腦部的接觸印痕及涂片，利用免疫熒光法進(jìn)行鑒定。應(yīng)用免疫熒光法在腎臟中可以收獲到較高水平的病毒陽(yáng)性熒光。研究表明，在感染早期應(yīng)用免疫熒光法可以在腎臟印痕中檢測(cè)到病毒。

2酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)

應(yīng)用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)在感染器官中直接檢測(cè)錦鯉皰疹病毒抗原的方法在很多實(shí)驗(yàn)室中都尚未發(fā)展成熟，一些相關(guān)試驗(yàn)還有待于進(jìn)一步研究。目前，以色列的研究人員建立了在魚(yú)類(lèi)排泄物(糞便)中檢測(cè)錦鯉皰疹病毒的ELISA方法。

抗體檢測(cè)

研究人員抽取魚(yú)的血液進(jìn)行抗體檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)產(chǎn)生抗體的細(xì)胞需要一段時(shí)間才能激活，而且一旦激活多種魚(yú)類(lèi)將會(huì)產(chǎn)生永久性免疫。魚(yú)體在感染錦鯉皰疹病毒時(shí)，其自身免疫狀態(tài)(特異性免疫與非特異性免疫)在抵御皰疹病毒入侵時(shí)起著至關(guān)重要的作用;當(dāng)水溫在18℃以上時(shí)魚(yú)類(lèi)的免疫應(yīng)答處于最佳狀態(tài)，此時(shí)鯉魚(yú)感染病毒后機(jī)體所產(chǎn)生的抗體可以抵抗病毒。研究表明，機(jī)體在感染病毒3周后，其血清中可以通過(guò)ELISA方法檢測(cè)到抗體的存在，而自然感染病愈1年后的鯉魚(yú)也能檢測(cè)到這些抗體。雖然，含有錦鯉皰疹病毒抗體的錦鯉血清能與鯉魚(yú)皰疹病毒1型出現(xiàn)交叉反應(yīng)，但研究人員發(fā)現(xiàn)，通過(guò)ELISA方法仍能檢測(cè)到具有較低含量的錦鯉皰疹病毒抗體;因此，免疫學(xué)方法可以檢測(cè)外觀十分健康的初期感染者，由于PCR方法在病毒含量較低時(shí)容易出現(xiàn)陰性反應(yīng)，所以免疫學(xué)方法檢測(cè)抗體也許是唯一有效的監(jiān)測(cè)手段。但是，對(duì)魚(yú)類(lèi)病毒感染的免疫學(xué)方法研究較少，相信隨著血清學(xué)診斷技術(shù)的日臻完善，應(yīng)用免疫學(xué)方法在假定健康的魚(yú)群中篩選病毒初期感染者將會(huì)成為可能。

分子生物學(xué)診斷技術(shù)

1PCR方法

PCR是比較準(zhǔn)確的診斷錦鯉皰疹病毒的方法;因此，國(guó)際獸疫局將其列為推薦方法之一。截止到2006年，運(yùn)用PCR技術(shù)確診的錦鯉皰疹病毒感染的陽(yáng)性病料在德國(guó)有45例、英國(guó)16例以上、荷蘭1例、美國(guó)2例，以色列確診的病例也是應(yīng)用此技術(shù)完成的。有人用錦鯉皰疹病毒的1個(gè)保守片段建立PCR方法，可用來(lái)區(qū)分錦鯉皰疹病毒、鯉魚(yú)皰疹病毒(CHV)和海峽鯰魚(yú)病毒(CCV)。

2004年，T．Ishioka等運(yùn)用PCR技術(shù)對(duì)發(fā)生在日本的43份錦鯉皰疹病毒可疑病例進(jìn)行了分子流行病學(xué)檢測(cè)，之后又利用錦鯉皰疹病毒的主要囊膜蛋白基因和聚合酶基因的核苷酸序列設(shè)計(jì)了相應(yīng)引物，并進(jìn)行PCR擴(kuò)增。結(jié)果表明，有37份樣品檢出陽(yáng)性，檢出率為86%。有研究人員認(rèn)為，ORF25編碼的蛋白在病毒的突變位點(diǎn)不易發(fā)生變化，屬于較為保守的基因序列;因此，利用該基因進(jìn)行PCR檢測(cè)特異性較高。

H．Ber-covier等用錦鯉皰疹病毒的胸苷激酶基因建立的PCR方法可區(qū)分錦鯉皰疹病毒、海峽鯰魚(yú)病毒和鯉魚(yú)皰疹病毒。2002年在廣東省爆發(fā)的疑似錦鯉皰疹病毒病原感染中，劉葒等人建立的檢測(cè)方法發(fā)揮了積極的作用，同時(shí)也預(yù)示著我國(guó)同樣存在受貿(mào)易往來(lái)所導(dǎo)致的錦鯉皰疹病毒爆發(fā)的風(fēng)險(xiǎn)，并提前為我國(guó)預(yù)防和控制該病提供了技術(shù)支持。烏日琴等分別利用2種方法抽提組織中錦鯉皰疹病毒的DNA，證實(shí)蛋白酶K－酚/氯仿抽提法不能達(dá)到從組織中抽提錦鯉皰疹病毒DNA的目的，同時(shí)也評(píng)價(jià)了2套引物檢測(cè)的特異性，初步建立了反應(yīng)快速、操作簡(jiǎn)便、靈敏度高的檢測(cè)錦鯉皰疹病毒的PCR方法。孟慶峰等通過(guò)使用靶基因序列合成的相關(guān)引物檢測(cè)錦鯉皰疹病毒。

結(jié)果表明，所用靶基因均可用于錦鯉皰疹病毒的檢測(cè)及其確證試驗(yàn)。但是，PCR檢測(cè)方法也有自身的局限性，它只能從出現(xiàn)臨床癥狀的病魚(yú)體內(nèi)檢測(cè)到錦鯉皰疹病毒，還不能預(yù)知潛在的病毒感染，同時(shí)假陽(yáng)性、假陰性及氣溶膠污染等也給PCR方法帶來(lái)一些弊端。

2探針檢測(cè)

對(duì)于公布的單循環(huán)PCR方法，最近被認(rèn)為是從臨床患病的鯉魚(yú)體內(nèi)采取新鮮器官樣品中檢測(cè)錦鯉皰疹病毒DNA最為敏感的，該規(guī)程同樣可以應(yīng)用于檢測(cè)具有亞臨床癥狀的病毒，首先應(yīng)用TK探針發(fā)展該規(guī)程的是以色列希伯來(lái)大學(xué)－Hadassah醫(yī)學(xué)院的研究人員。其后日本學(xué)者也對(duì)此進(jìn)行了相關(guān)研究，并對(duì)其進(jìn)行了改進(jìn)。研究表明，若使用的器官樣品有腐爛跡象，則需要用探針位點(diǎn)靶向基因組的稍短區(qū)域。

3環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)(LAMP)

環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)是一種新型的恒溫核酸擴(kuò)增方法，它能特異性識(shí)別靶核苷酸上6個(gè)位點(diǎn)的4對(duì)引物及具有鏈置換活性的DNA聚合酶，在60～65℃條件下進(jìn)行核酸的指數(shù)式擴(kuò)增，其擴(kuò)增效率在1×10－9～1×10－10數(shù)量級(jí)上，其反應(yīng)的原理是在擴(kuò)增的過(guò)程中產(chǎn)生莖環(huán)結(jié)構(gòu)，以保證引物和模板雜交后啟動(dòng)新一輪的擴(kuò)增反應(yīng)，反應(yīng)的副產(chǎn)物焦磷酸鎂沉淀是肉眼可見(jiàn)的，若反應(yīng)中添加顯色劑，通過(guò)擴(kuò)增過(guò)程顏色的變化，還可以目測(cè)整個(gè)反應(yīng)過(guò)程。該方法的優(yōu)點(diǎn)是快速、簡(jiǎn)便、廉價(jià)、肉眼可觀測(cè)到反應(yīng)的發(fā)生，并且不需要特殊的PCR反應(yīng)儀器，非常適合現(xiàn)場(chǎng)診斷;因此，該方法有很好的應(yīng)用前景。H．Soliman等通過(guò)設(shè)計(jì)的3對(duì)引物建立了錦鯉皰疹病毒的環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)，該方法在90min內(nèi)即可完成，省時(shí)、省力并且直觀。I．Gunimaladevi等利用錦鯉皰疹病毒胸苷激酶基因設(shè)計(jì)引物建立的環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)，其靈敏度與普通PCR方法相當(dāng)。

結(jié)語(yǔ)

傳統(tǒng)檢測(cè)錦鯉皰疹病毒的方法仍為病毒分離鑒定，而分子生物學(xué)檢測(cè)因具有更加靈敏、特異、快速的特點(diǎn)，成為當(dāng)前檢測(cè)的發(fā)展方向。目前，人們?nèi)灾铝τ谘芯恳恍┬碌臋z測(cè)方法以滿(mǎn)足需要，國(guó)際上分子生物學(xué)檢測(cè)后的測(cè)序正逐漸成為實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)的確證試驗(yàn)。隨著國(guó)際貿(mào)易的不斷往來(lái)，錦鯉皰疹病毒作為水生動(dòng)物主要疫病越來(lái)越被重視;因此，只有未雨綢繆、早做預(yù)防，才能減少疫病傳入造成的巨大經(jīng)濟(jì)損失。