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《動(dòng)物醫(yī)學(xué)進(jìn)展雜志》2016年第9期

摘要：

為制備犬細(xì)小病毒膠體金免疫層析試紙，將F81細(xì)胞中分離的CPV免疫Balb／c小鼠，取其脾細(xì)胞與骨髓瘤細(xì)胞融合，建立間接ELISA方法篩選分泌CPV單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞，獲得1株能穩(wěn)定分泌CPV單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞株，命名為3E2。3E2的亞類為IgG1型，腹水抗體效價(jià)為1．8×105，交叉試驗(yàn)表明，3E2可與CPV特異性結(jié)合，與其他犬常見病毒無交叉反應(yīng)。用3E2單克隆抗體制備的檢測(cè)CPV的膠體金免疫層析試紙條特異性良好，為診斷和研究CPV奠定了基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞：

犬細(xì)小病毒；病毒分離；單克隆抗體；膠體金免疫層析試紙

犬細(xì)小病毒病是由犬細(xì)小病毒所引起的傳染性疾病，可通過直接或間接接觸傳播，以劇烈的嘔吐、腹瀉和白細(xì)胞減少為主要特點(diǎn)，可引起犬急性心肌炎。犬細(xì)小病毒傳播性強(qiáng)，發(fā)病率和病死率較高，且可感染狐、貉、狼等動(dòng)物，對(duì)養(yǎng)犬業(yè)和皮毛動(dòng)物等經(jīng)濟(jì)動(dòng)物養(yǎng)殖業(yè)可造成巨大經(jīng)濟(jì)損失［1］。1977年，美國(guó)科學(xué)家最先從患腸炎的犬糞便中分離出CPV。1983年，徐漢坤等首次報(bào)道了犬細(xì)小病毒病在我國(guó)的出現(xiàn)。CPV在分類上屬細(xì)小病毒科，病毒呈圓形或六邊形，無囊膜，直徑約25nm。病毒顆粒具有球型的衣殼，衣殼內(nèi)包含單鏈線狀DNA，在DNA兩端各有一個(gè)發(fā)夾樣的回文結(jié)構(gòu)，DNA量占整個(gè)病毒粒子重量的25％～34％。CPV基因主要編碼結(jié)構(gòu)蛋白VP1、VP2、VP3和非結(jié)構(gòu)蛋白NS1、NS2。VP1和VP2構(gòu)成病毒的衣殼，其中VP2是主要結(jié)構(gòu)成分和免疫原性蛋白，能夠促使機(jī)體產(chǎn)生中和抗體［2］。VP1和VP2蛋白對(duì)病毒與宿主細(xì)胞之間的識(shí)別起重要作用，刪除VP1或VP2蛋白的突變體均失去了對(duì)宿主細(xì)胞的感染能力。近年來，CPV非結(jié)構(gòu)蛋白NS1被認(rèn)為在病毒的致病性和細(xì)胞毒方面起主要作用，并在體外可引起腫瘤細(xì)胞凋亡［3－5］。目前國(guó)內(nèi)外對(duì)犬細(xì)小病毒的診斷主要通過臨床癥狀診斷、血常規(guī)檢查和試紙快速診斷等，前兩者存在著依賴臨床經(jīng)驗(yàn)、特異性低等缺點(diǎn)，難以達(dá)到對(duì)犬細(xì)小病毒病快速診斷的要求；而快速診斷試紙條主要被國(guó)外產(chǎn)品所壟斷［6］。本研究用F81細(xì)胞分離的CPV制備獲得了單克隆抗體，并用單克隆抗體，初步制備了CPV的膠體金層析快速檢測(cè)試紙條。

1材料與方法

1．1材料

1．1．1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物、細(xì)胞株及毒株

貓腎細(xì)胞系細(xì)胞（F81），購(gòu)自中國(guó)獸醫(yī)藥品監(jiān)察所；犬細(xì)小病毒病料，河南牧業(yè)經(jīng)濟(jì)學(xué)院動(dòng)物醫(yī)院提供；SP2／0多發(fā)性骨髓瘤細(xì)胞，河南牧業(yè)經(jīng)濟(jì)學(xué)院生物工程學(xué)院生物技術(shù)實(shí)驗(yàn)室保存；Balb／c小鼠和日本長(zhǎng)耳大白兔，購(gòu)自河南農(nóng)業(yè)大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心；含有CPVVP2基因的重組質(zhì)粒pGEX－6p－1－VP2，河南牧業(yè)經(jīng)濟(jì)學(xué)院生物工程學(xué)院生物技術(shù)實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建并保存；犬瘟熱病毒（CDV）、犬冠狀病毒（CCV）和犬腺狀病毒（CAV），河南牧業(yè)經(jīng)濟(jì)學(xué)院生物工程學(xué)院生物技術(shù)實(shí)驗(yàn)室鑒定并保存。

1．1．2主要試劑與藥品

dNTP、DNA提取試劑盒、瓊脂糖、DNAMarkerDL2000和蛋白分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)等，寶生物工程（大連）有限公司產(chǎn)品；DMEM、弗氏完全佐劑、弗氏不完全佐劑、50倍HAT貯存液，GIBCO公司產(chǎn)品；胎牛血清，Hyclone公司產(chǎn)品；HRP－羊抗鼠IgG、HRP－羊抗兔IgG、羊抗鼠IgG抗體、PEG4000、DMSO、BSA及氯金酸，Sigma公司產(chǎn)品；硝酸纖維素膜（NC膜），Millipore公司產(chǎn)品；樣品墊和PVC底板，上海金標(biāo)生物科技有限公司產(chǎn)品；SBAClonotypingSystem／HRP抗體亞類鑒定試劑盒，SouthernBiotechnology公司產(chǎn)品；引物合成和序列測(cè)定由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司完成；CPV多抗IgG由河南牧業(yè)經(jīng)濟(jì)學(xué)院生物工程學(xué)院生物技術(shù)實(shí)驗(yàn)室制備；犬細(xì)小病毒陰性血清由河南牧業(yè)經(jīng)濟(jì)學(xué)院動(dòng)物醫(yī)院提供；其他常規(guī)用試劑為國(guó)產(chǎn)或進(jìn)口分析純。

1．2方法

1．2．1病毒的鑒定

樣品由河南牧業(yè)經(jīng)濟(jì)學(xué)院動(dòng)物醫(yī)院提供。采集出現(xiàn)血便、高熱等疑似CPV感染的犬糞便，加入適量磷酸鹽緩沖液，5000r／min離心10min，收獲上清液。按常規(guī)DNA提取方法提取DNA，置于－20℃保存?zhèn)溆谩⒄誄PV基因序列（基因登錄號(hào)：M19296．1），設(shè)計(jì)引物序列為：上游引物P1：5′－AATCACAGCAAACTCAAG－CAGAC－3′；下游引物P2：5′－TAGCAAATTCAT－CACCTGTTCTTAG－3′。以提取的DNA樣品為模板，使用Taq酶擴(kuò)增，反應(yīng)條件為：94℃5min；94℃30s，55℃30s，72℃60s，共30個(gè)循環(huán)；最后72℃10min。取PCR反應(yīng)產(chǎn)物5μL用10g／L瓊脂糖凝膠電泳觀察結(jié)果［7］。

1．2．2病毒的分離和抗原的制備

將采集的病料加入含1000單位／mL青霉素和鏈霉素的DMEM細(xì)胞維持液（含20mL／L胎牛血清）制成1∶9的懸液，混勻后5000r／min離心20min，取上清，用0．22μm微孔濾膜過濾，置－20℃保存?zhèn)溆谩螌拥腇81細(xì)胞用胰蛋白酶消化，按1∶2傳代，按體積10％的病料上清同步接種F81細(xì)胞，置37℃、體積分?jǐn)?shù)為5％的CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，設(shè)立陰性對(duì)照，同時(shí)逐日觀察細(xì)胞病變并進(jìn)行盲傳［8－9］。待細(xì)胞病變達(dá)到80％以上時(shí)，反復(fù)凍融3次，10000r／min4℃離心30min，收獲上清，加入PEG6000濃縮，經(jīng)過Sepharose4FF凝膠柱層析，收集洗脫峰即為CPV抗原，紫外分光法檢測(cè)CPV濃度，保存于－80℃。

1．2．3間接ELISA檢測(cè)方法的建立

以純化的VP2蛋白作為包被抗原［10］，采用方陣滴定確定陽(yáng)性血清的最佳濃度和最佳抗原包被濃度，建立了間接ELISA方法。通過酶標(biāo)儀讀取OD值判定結(jié)果，以O(shè)D待檢血清＞0．4且P／N≥2．1為陽(yáng)性判定標(biāo)準(zhǔn)。另外檢測(cè)30份犬細(xì)小病毒陰性血清450nm波長(zhǎng)處的OD值，并將平均OD值與3倍的標(biāo)準(zhǔn)差（SD）之和作為陰陽(yáng)性的臨界值，即珚x＋3SD為確定的陰陽(yáng)性界限［11］。

1．2．4小鼠的免疫

將純化的CPV抗原加等體積弗氏完全佐劑初次免疫6周齡Balb／c小鼠，每隔2周分別再注射2次以加強(qiáng)免疫。細(xì)胞融合前3d再加強(qiáng)免疫1次注射抗原。

1．2．5雜交瘤細(xì)胞的篩選和McAb腹水制備

按常規(guī)方法進(jìn)行細(xì)胞融合，使用建立的間接ELISA方法篩選陽(yáng)性雜交瘤細(xì)胞，有限稀釋法進(jìn)行克隆化培養(yǎng)，選擇能夠穩(wěn)定分泌、效價(jià)較高的單個(gè)克隆進(jìn)行培養(yǎng)。按常規(guī)方法制備腹水，并采用辛酸－硫酸銨鹽析法和親和層析法純化腹水中的McAb［12］。

1．2．6McAb亞型鑒定及染色體計(jì)數(shù)

①采用SBAClonotypingSystem／HRP抗體亞類鑒定試劑盒測(cè)定制備的CPVMcAb的Ig亞類。②選擇生長(zhǎng)良好的雜交瘤細(xì)胞，用秋水仙素阻斷法進(jìn)行染色體核型分析，在顯微鏡下選擇染色體分散良好的細(xì)胞觀察計(jì)數(shù)。

1．2．7McAb的特異性分析

將犬細(xì)小病毒（CPV）、犬瘟熱病毒（CPV）、犬冠狀病毒（CPV）和犬腺病毒Ⅱ型（CAV）作為包被抗原進(jìn)行間接ELISA，檢測(cè)該單克隆抗體的特異性。

1．2．8膠體金抗體的制備

將200mL0．1g／L氯金酸溶液，攪拌加熱至沸騰，迅速加入2mL10g／L檸檬酸三鈉溶液，溶液顏色從淺黃逐漸變黑，然后變紅，繼續(xù)煮沸10min，溶液冷卻后微孔濾膜過濾，4℃下保存?zhèn)溆谩⒅苽涞哪z體金，調(diào)整pH至8．0后加純化后的3E2單抗攪拌，室溫靜止5min，經(jīng)低溫高速離心法純化獲得膠體金抗體［13］。

1．2．9免疫試紙條的制備和初步鑒定

在玻璃纖維上噴涂膠體金抗體。取蛋白濃度為1．5mg／mL的CPV多抗IgG標(biāo)記在硝酸纖維素膜上，設(shè)為檢測(cè)線；取蛋白濃度為1．0mg／mL的羊抗鼠IgG抗體噴在離檢測(cè)線5mm處，即為質(zhì)控線；將噴有檢測(cè)線和質(zhì)控線的硝酸纖維素膜與樣品墊、膠體金墊、NC膜、吸水紙組裝成試紙條。取PCR和ELISA鑒定的犬細(xì)小病毒（CPV）、犬瘟熱病毒（CDV）、犬冠狀病毒（CCV）和犬腺病毒Ⅱ型（CAV），用制備的膠體金試紙條進(jìn)行檢測(cè)，驗(yàn)證其特異性。

2結(jié)果

2．1PCR鑒定

通過PCR擴(kuò)增，得到608bp左右的預(yù)期大小目的片段，經(jīng)測(cè)序與預(yù)期序列一致，證明樣品中含有CPV（圖1）。

2．2病毒的分離

從第3代開始一般會(huì)出現(xiàn)規(guī)律性細(xì)胞病變，接種病料上清液后約24h～36h，細(xì)胞出現(xiàn)彌散性顆粒，胞漿收縮，細(xì)胞變圓；約48h病變細(xì)胞開始逐漸拉網(wǎng)、崩解、脫落；約72h～96h，細(xì)胞病變達(dá)80％以上時(shí)，收毒，置－80℃保存?zhèn)溆茫▓D2）。

2．3間接ELISA方法建立

采用方陣滴定確定抗原的最佳包被濃度和陽(yáng)性血清最佳稀釋度，陽(yáng)性判斷標(biāo)準(zhǔn)為OD待檢血清＞0．4，且OD待檢血清／OD標(biāo)準(zhǔn)陰性值≥2．1，當(dāng)抗原的稀釋濃度為1∶160，血清的稀釋度為1∶80，陰性與陽(yáng)性血清的OD450nm值相差最大（P／N＝9．253）。建立了篩選犬細(xì)小病毒McAb的間接ELISA方法（表1）。

2．4雜交瘤細(xì)胞株的篩選

經(jīng)脾細(xì)胞與骨髓瘤細(xì)胞SP2／0細(xì)胞融合并篩選，獲得1株能高效分泌抗CPV單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞株，命名為3E2。間接ELISA檢測(cè)，3E2腹水效價(jià)為1∶1．8×105。

2．5McAb的Ig亞類鑒定檢測(cè)

抗體的Ig亞類，結(jié)果表明，3E2亞類為IgG1型。

2．6雜交瘤細(xì)胞染色體數(shù)目

Balb／c小鼠脾細(xì)胞的染色體為40條，SP2／0骨髓瘤細(xì)胞的染色體為62條。統(tǒng)計(jì)結(jié)果表明，該細(xì)胞株染色體數(shù)介于90條～100條，大約為小鼠脾細(xì)胞和SP2／0骨髓瘤細(xì)胞染色體數(shù)目之和，說明為兩者融合產(chǎn)生（圖3）。

2．7McAb的特異性檢測(cè)

將3E2分別與犬細(xì)小病毒（CPV）、犬瘟熱病毒（CDV）、犬冠狀病毒（CCV）和犬腺病毒Ⅱ型（CAV）包被的ELISA板進(jìn)行交叉反應(yīng)試驗(yàn)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，3E2與CPV可發(fā)生陽(yáng)性反應(yīng)，與CDV、CCV和CAV不發(fā)生反應(yīng)，表明制備的McAb與其他犬常見病毒沒有交叉反應(yīng)，制備的3E2單克隆抗體有良好的特異性（表2）。

2．8膠體金溶液的制備

制成的膠體金溶液日光下肉眼觀察透明清亮、顏色為酒紅色、無沉淀。經(jīng)紫外分光光度計(jì)檢測(cè)其最大吸收波長(zhǎng)為525nm。

2．9膠體金免疫層析試紙的特異性

特異性試驗(yàn)結(jié)果顯示犬瘟熱病毒（CDV）、犬冠狀病毒（CCV）和犬腺病毒Ⅱ型（CAV）在膠體金免疫層析試紙檢測(cè)線上均無條帶，為陰性。犬細(xì)小病毒（CPV）在檢測(cè)線上均出現(xiàn)特異性條帶，為陽(yáng)性（圖4）。

3討論

犬細(xì)小病毒病傳播性強(qiáng)，發(fā)病率和病死率較高，且一年四季都有發(fā)生，絕大多數(shù)年齡、品種的犬類都可被傳染，但幼犬和純種犬更易被感染，病死率也高［14－15］。細(xì)小病毒感染犬類后，一旦發(fā)病治愈率特別低，沒有特效藥，早期確定犬細(xì)小病毒病并予以抗病毒、消炎、補(bǔ)液和止嘔等治療，可以提高療效和存活率，因此，對(duì)CPV的早期檢測(cè)就非常關(guān)鍵［16－19］。膠體金免疫層析試紙檢測(cè)方法只需將待測(cè)溶液加入試紙條中，靜止后一段時(shí)間觀察結(jié)果，不需要儀器設(shè)備來讀取結(jié)果，不需要操作者有專業(yè)技能，能減少很大檢測(cè)工作量和節(jié)省大量檢測(cè)費(fèi)用，敏感性高，特異性好［20］。但目前我國(guó)市場(chǎng)上部分CPV試紙條主要以國(guó)外進(jìn)口為主，價(jià)格較為昂貴，市場(chǎng)較為廣闊。我們以分離得到并純化的CPV為抗原，多次腹腔注射免疫小鼠獲得了能夠分泌抗CPVMcAb的脾細(xì)胞，ELISA試驗(yàn)結(jié)果表明該雜交瘤細(xì)胞產(chǎn)生的McAb只與CPV發(fā)生特異性反應(yīng)，與CDV、CCV和CAV無明顯的交叉反應(yīng)，表明制備的3E2單克隆抗體有良好的特異性。另外，經(jīng)間接ELISA檢測(cè)，3E2腹水效價(jià)為1∶1．8×105。本試驗(yàn)確定了標(biāo)記的最佳條件，設(shè)定3E2為金標(biāo)抗體、取蛋白濃度為1．5mg／mL的CPV多抗IgG標(biāo)記為檢測(cè)線，蛋白濃度為1．0mg／mL的兔抗鼠IgG高免血清標(biāo)記為質(zhì)控線，初步建立了膠體金免疫層析方法。本試驗(yàn)建立的診斷方法特異性強(qiáng)，與其他3種犬常見病毒抗原無交叉反應(yīng)，具有較好的重復(fù)性，與ELISA方法結(jié)果一致，可用于CPV的快速檢測(cè)。下一步我們將在反應(yīng)條件、穩(wěn)定性及工藝上進(jìn)一步改進(jìn)，以期進(jìn)一步提高檢測(cè)靈敏度。本研究分離并純化了CPV，經(jīng)免疫Balb／c小鼠后，通過雜交瘤技術(shù)獲得了1株高親和力和高特異性的雜交瘤細(xì)胞，經(jīng)鑒定制備出的McAb效價(jià)高、特異性強(qiáng)。并在此基礎(chǔ)上研發(fā)了膠體金免疫層析檢測(cè)試紙條，快捷準(zhǔn)確，在臨床上具有很好的應(yīng)用前景，有一定的社會(huì)和經(jīng)濟(jì)價(jià)值，并為犬細(xì)小病毒的深入研究奠定了基礎(chǔ)。

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作者:馬輝 權(quán)國(guó)輝 喬宏興 鄭鳴 趙緒永 王永芬 邊傳周 單位:河南牧業(yè)經(jīng)濟(jì)學(xué)院生物工程學(xué)院 鄭州職業(yè)技術(shù)學(xué)院材料工程系