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《廣東農(nóng)業(yè)科學(xué)雜志》2015年第二十期

白蠟多年菌（Perenniporiafraxinea）是一種多孔菌科多年菌屬的珍稀食藥用真菌。野生白蠟多年菌在北京、安徽、湖南、廣東等地均有發(fā)現(xiàn)，多長于腐朽的樹上［1］。作為野生食藥用菌，它富含糖類活性物質(zhì)，并具有較高的營養(yǎng)價值［2］。目前，國內(nèi)外對白蠟多年菌進行的研究主要在其菌絲纖溶蛋白酶的分離純化及表征方面［3］，但關(guān)于白蠟多年菌液體培養(yǎng)條件的相關(guān)研究尚不多見。為此，本試驗研究白蠟多年菌液體培養(yǎng)的碳氮源及培養(yǎng)條件對其胞外多糖含量的影響，以期為白蠟多年菌的開發(fā)利用及其多糖的工業(yè)化生產(chǎn)提供建論依據(jù)。

1材料與方法

1.1試驗材料供試菌株：白蠟多年菌（Perenniporiafraxinea）菌株，由華南師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院提供。主要儀器與設(shè)備：2-16K通用臺式離心機（美國Sigma公司），UV2450紫外-可見分光光度儀（日本島津公司），pH計（北京時代新維測控設(shè)備有限公司）。

1.2試驗方法

1.2.1單因素及正交試驗以胞外多糖含量為指標(biāo)，考察碳源（葡萄糖、麥芽糖、D-果糖、蔗糖、可溶性淀粉，濃度分別為25、30、35、40、45g/L）、氮源〔NH4NO3、（NH4）2SO4、尿素、KNO3、L-谷氨酰胺，氮原子含量為50mmol/L，濃度分別為0.5、1、2、4、8g/L〕、培養(yǎng)液初始pH（5.5、6.0、6.5、7.0、7.5）、裝液量（50、75、100、125、150mL/250mL）、溫度（18、21、24、27、30℃）、搖床轉(zhuǎn)速（120、150、180、210、240r/min）及培養(yǎng)時間（5、7、9、11、13d）對菌絲產(chǎn)胞外多糖的影響。在單因素試驗的基礎(chǔ)上，以正交試驗考察溫度、初始pH、裝液量、培養(yǎng)時間對白蠟多年菌液體培養(yǎng)產(chǎn)胞外多糖的影響，正交試驗設(shè)計見表1。上述各處理組試驗步驟為：將菌株轉(zhuǎn)接于母種培養(yǎng)基的培養(yǎng)皿內(nèi)，制成平板菌種，用同一打孔器在平板菌種的同一半徑上打孔，將4個菌栓接入試驗培養(yǎng)基，置于搖床振蕩培養(yǎng)。

1.2.2指標(biāo)測定將發(fā)酵液于8000r/min離心5min，棄沉淀，取上清液備用。總糖含量使用苯酚-硫酸法測定［4］；還原糖含量用二硝基水楊酸（DNS）法測定［5］；胞外多糖含量是總糖含量與還原糖含量之差［6］。試驗數(shù)據(jù)用SPSS13.0處理系統(tǒng)進行統(tǒng)計，采用LSD法（最小顯著性差異法）進行數(shù)據(jù)間的方差分析［7］。

2結(jié)果與分析

2.1碳源對菌絲產(chǎn)胞外多糖的影響從圖1可以看出，白蠟多年菌菌絲在5種不同碳源的液體培養(yǎng)基上都可產(chǎn)胞外多糖，但是其胞外多糖含量存在差異。以蔗糖作為碳源時，胞外多糖含量最高、達到47.56g/L，極顯著高于其他碳源。因此，白蠟多年菌菌絲產(chǎn)胞外多糖適宜碳源是蔗糖，這與前人對樺褐孔菌、靈芝等最適碳源的研究結(jié)果一致。由圖2可知，菌絲在蔗糖濃度25~45g/L范圍內(nèi)均可產(chǎn)生胞外多糖，但其含量有一定差異。隨著蔗糖濃度的增高，胞外多糖含量逐漸升高，當(dāng)蔗糖濃度為40g/L時，胞外多糖含量最高、為57.28g/L，極顯著高于其他濃度的胞外多糖含量。當(dāng)蔗糖濃度為45g/L時，菌絲胞外多糖含量反而減少。可見蔗糖濃度過高或過低都會影響白蠟多年菌對碳素營養(yǎng)的吸收，導(dǎo)致胞外多糖含量降低。因此，最適宜白蠟多年菌產(chǎn)胞外多糖的蔗糖濃度為40g/L。

2.2不同氮源對菌絲產(chǎn)胞外多糖的影響由圖3可知，不同氮源培養(yǎng)基中胞外多糖含量由高至低順序為硝酸銨、硫酸銨、L-谷氨酰胺、尿素、硝酸鉀。菌絲體在以硝酸銨為氮源的培養(yǎng)基中胞外多糖含量最高、為65.48g/L，極顯著高于其他氮源培養(yǎng)基中的胞外多糖含量；當(dāng)以硝酸鉀為氮源時，菌絲胞外多糖含量最少、僅有22.48g/L。因此，白蠟多年菌液體發(fā)酵產(chǎn)胞外多糖的適宜氮源為硝酸銨。從圖4可看出，當(dāng)硝酸銨濃度小于1g/L時，菌絲胞外多糖的含量隨著濃度的增加而增加；當(dāng)硝酸銨濃度為1g/L時，胞外多糖含量最高、達87.15g/L，高于其他濃度；當(dāng)硝酸銨濃度大于1g/L時，胞外多糖含量隨著濃度的增加反而減少。可見，過量或過低的氮素營養(yǎng)不僅妨礙了菌絲對氮源本身的吸收，還影響了對其他營養(yǎng)物質(zhì)的利用，影響了菌絲胞外多糖的產(chǎn)量。因此，為獲得更多的胞外多糖，菌絲液體培養(yǎng)基中硝酸銨濃度以1g/L為宜。

2.3不同初始pH值對菌絲產(chǎn)胞外多糖的影響由圖5可知，菌絲在初始pH為5.5~7.5范圍的培養(yǎng)基內(nèi)均可產(chǎn)生胞外多糖，在初始pH為5.5時菌絲產(chǎn)胞外多糖少，隨著初始pH的增大，菌絲胞外多糖含量也不斷增加。當(dāng)初始pH為6.5時，胞外多糖量達到最高值、為36.61g/L。隨著pH進一步升高，胞外多糖含量逐漸下降，當(dāng)初始pH為7.5時，胞外多糖含量最少，僅有21.45g/L。因此，白蠟多年菌更適合在偏微酸性的環(huán)境中產(chǎn)生胞外多糖，最適初始pH為6.5。

2.4不同裝液量對菌絲產(chǎn)胞外多糖的影響由圖6可知，不同裝液量對于菌絲產(chǎn)胞外多糖有重要影響，隨著裝液量的增加，菌絲胞外多糖含量也逐漸增加，當(dāng)裝液量為75mL/250mL時，菌絲產(chǎn)胞外多糖含量最多、為31.59g/L。但隨著裝液量的進一步增加，菌絲的胞外多糖含量急劇下降，當(dāng)裝液量為125mL/250mL時，胞外多糖含量達最低值，僅有3.5g/L。這可能是過多裝液量影響培養(yǎng)液的氧量，導(dǎo)致菌絲生長不良而胞外多糖含量不高。因此，適于白蠟多年菌菌絲產(chǎn)胞外多糖的裝液量為75mL/250mL。

2.5不同轉(zhuǎn)速對菌絲產(chǎn)胞外多糖的影響從圖7可以看出，隨著轉(zhuǎn)速的增大，胞外多糖含量逐漸增加。當(dāng)轉(zhuǎn)速為150r/min時，胞外多糖含量達到最大，為40.17g/L；但隨著轉(zhuǎn)速進一步增加，胞外多糖含量急劇下降，當(dāng)轉(zhuǎn)速為240r/min時，胞外多糖含量最低，僅有9.58g/L?？梢姡瑥娏C械振蕩會損傷細(xì)胞結(jié)構(gòu)，也可能導(dǎo)致胞質(zhì)營養(yǎng)交換過快，不利于菌絲生長及胞外多糖的分泌。因此，150r/min為白蠟多年菌菌絲產(chǎn)胞外多糖的適宜轉(zhuǎn)速。

2.6不同培養(yǎng)溫度對菌絲產(chǎn)胞外多糖的影響由圖8可知，在18~27℃的溫度范圍內(nèi)，隨著溫度的升高，胞外多糖含量逐漸升高，在27℃培養(yǎng)時胞外多糖含量最高，達到54.94g/L；但當(dāng)溫度超過27℃時，胞外多糖含量急劇下降，在30℃時胞外多糖含量僅有10.01g/L。溫度對菌絲生長和代謝作用的影響較大，菌絲產(chǎn)胞外多糖最適宜的培養(yǎng)溫度為27℃。

2.7不同培養(yǎng)時間對菌絲產(chǎn)胞外多糖的影響由圖9可知，培養(yǎng)時間是影響菌絲產(chǎn)胞外多糖的重要因子。隨著培養(yǎng)時間的增加，胞外多糖含量逐漸上升，培養(yǎng)9d后達到最大值，為31.46g/L。此后，隨著培養(yǎng)時間的延長，菌絲老化，菌絲的產(chǎn)胞外多糖量也逐漸下降。因此，為獲得較多的胞外多糖，培養(yǎng)時間以9d適宜。

2.8正交試驗溫度、起始pH、裝液量、培養(yǎng)時間對菌絲胞外多糖含量影響的正交試驗結(jié)果見表2。從表2的極差R可知，四因素對白蠟多年菌產(chǎn)胞外多糖的影響由大到小順序為初始pH＞溫度＞裝液量＞培養(yǎng)時間，極差計算所得的產(chǎn)胞外多糖量較優(yōu)的組合為A3B1C3D2，即溫度27℃、起始pH5.5、裝液量125mL/250mL、培養(yǎng)9d。對本試驗確定的最佳培養(yǎng)條件組合進行試驗驗證，結(jié)果表明白蠟多年菌胞外多糖產(chǎn)量能維持在103.04g/L，比任一組正交試驗的胞外多糖含量都高。

3結(jié)論與討論

與菌絲固體培養(yǎng)相比，液體深層培養(yǎng)可以根據(jù)菌絲在生長過程中對碳源、氮源、生長因子等營養(yǎng)物質(zhì)及溫度、pH值、需氧量等條件的不同需要，合理配制，補加各種營養(yǎng)物質(zhì)和隨時調(diào)節(jié)溫度、pH值和通風(fēng)量，這就有可能把微生物培養(yǎng)過程的生長、代謝都控制在最佳狀態(tài)而收到最好的培養(yǎng)效果。另外，與寄主培養(yǎng)、固體培養(yǎng)和代料栽培相比，白蠟多年菌液體培養(yǎng)是一種獲得其多糖產(chǎn)物較為方便的途徑，并且也比較容易對其培養(yǎng)條件進行優(yōu)化及對其胞外多糖進行分離純化。目前大多數(shù)的菌絲發(fā)酵研究采用液體培養(yǎng)的方法。本試驗結(jié)果表明，白蠟多年菌的最適碳源為蔗糖，最適蔗糖濃度為40g/L，最適硝酸銨濃度為1g/L。由此可推知，該菌種適宜的碳氮比接近50∶1，這與前人對食用菌C/N值不大一致，這可能與菌種自身生理特性和培養(yǎng)的環(huán)境有關(guān)。在氮源試驗中，當(dāng)以硝酸銨、硫酸銨以及L-谷氨酰胺為氮源時，白蠟多年菌的胞外多糖含量較高，可見白蠟多年菌更喜好在導(dǎo)致培養(yǎng)基酸化的銨鹽或酰胺鹽中發(fā)酵產(chǎn)糖。從培養(yǎng)條件來看，通過對比單因素試驗和正交試驗結(jié)果可知，pH值的適宜范圍為5.5~6.5。這符合前人對擔(dān)子菌屬的菌種生長探究中得出的擔(dān)子菌對pH值的要求比較廣泛的結(jié)論，但總體來說白蠟多年菌適合在偏微酸性的環(huán)境下生長。白靈菇在培養(yǎng)的第4天產(chǎn)胞外多糖量達到最大值，而生物量在第8天達到最大值。在本試驗中，白蠟多年菌生物量在第7天達到最大值，產(chǎn)胞外多糖量在第9天達到最大值?？梢妼τ诎紫灦嗄昃鷣碚f，菌絲體生長優(yōu)先于產(chǎn)胞外多糖，這與白靈菇明顯不同。這說明白蠟多年菌的生長周期要比草菇菌和白靈菇長。有研究表明，多聚蛋白胨有利于灰樹花的菌絲體和胞外多糖的的生產(chǎn)，在本試驗中也發(fā)現(xiàn)同樣的規(guī)律，加少量蛋白胨的培養(yǎng)基更利于白蠟多年菌產(chǎn)胞外多糖和菌絲的生長。

作者：梁冬秋 張翔宇 張松 單位：華南師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院