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《廣西蠶業(yè)雜志》2016年第3期

摘要：

桑樹(shù)含有多種活性成分，如黃酮類物質(zhì)、多糖、生物堿等活性物質(zhì)，具有降血糖、降血脂、降血壓、抗氧化、提高人體免疫力等作用。活性物質(zhì)提取是藥理作用研究的關(guān)鍵和后續(xù)藥品與健康食品開(kāi)發(fā)的基礎(chǔ)。通過(guò)對(duì)桑葉、桑枝中總黃酮以及具有代表性的黃酮類化合物，如槲皮素、花青素、蘆丁，桑葉多糖、桑枝多糖，總生物堿以及具有代表性的生物堿類化合物1-脫氧野尻霉素（DNJ）的提取方法進(jìn)行綜述，為這幾種活性物質(zhì)的利用和開(kāi)發(fā)提供依據(jù)。

關(guān)鍵詞：

桑樹(shù)；活性成分；提取利用

中國(guó)是蠶桑產(chǎn)業(yè)的發(fā)源地，也是桑樹(shù)種植面積最大的國(guó)家之一，擁有豐富的桑樹(shù)品種資源。桑樹(shù)是落葉性多年生木本植物，自古以來(lái)就被認(rèn)作是藥食兩用的珍貴材料，現(xiàn)代科學(xué)也已經(jīng)證實(shí)了桑樹(shù)資源的營(yíng)養(yǎng)成分、藥理活性成分及作用機(jī)理［1］。桑葉是家蠶唯一的飼料，同時(shí)還可入藥，早在《本草綱目》［2］中就有記載：“桑葉乃手足陽(yáng)明之藥，汁煎代茗，能止消渴，明目長(zhǎng)發(fā)。”現(xiàn)代科學(xué)研究結(jié)果表明桑葉中有著多種的有效活性成分，諸如黃酮類化合物、生物堿（DNJ等）、多糖、葉蛋白等。桑枝主要指桑樹(shù)的一年生枝條，據(jù)《中國(guó)藥典》記載，桑枝作為常用的中藥材，有著祛風(fēng)濕，利關(guān)節(jié)，行水之功效，適用于風(fēng)寒濕痹、四肢拘攣、腳氣浮腫之病癥。現(xiàn)代藥理學(xué)研究表明，桑枝主要含有多糖、黃酮類化合物、香豆精類化合物、生物堿等活性物質(zhì)。此外還含有揮發(fā)油、氨基酸、有機(jī)酸以及各類維生素，其具有抗真菌、消炎、降血糖、清除體內(nèi)超氧離子自由基的作用［3-7］。本文主要對(duì)桑枝桑葉活性物質(zhì)提取方法進(jìn)行綜述，以期為桑樹(shù)資源的多元化開(kāi)發(fā)提供參考。

1桑葉、桑枝中黃酮類物質(zhì)

1.1桑葉、桑枝中黃酮類化合物

黃酮類物質(zhì)是桑葉發(fā)揮功效的主要活性成分之一，具有降血糖、降血脂、降血壓、抗氧化、抗衰老、抗腫瘤、抗病毒等作用［8］。目前，對(duì)其藥理作用研究最多的是降血糖作用。從桑葉、桑枝中提取黃酮類物質(zhì)用來(lái)開(kāi)發(fā)降血糖、降血脂、降血壓和抗腫瘤方面的藥物和健康食品，將為糖尿病患者、心血管病患者帶來(lái)福音。桑樹(shù)中黃酮類物質(zhì)較為豐富，其主要分為黃酮類、黃酮醇類、二氫黃酮醇類、花色素類等四大類物質(zhì)，包括槲皮素、桑色素、花青素等4000余種化合物［9-10］。

1.2桑葉、桑枝中黃酮類化合物提取方法

1.2.1桑葉、桑枝中總黃酮的提取方法

桑葉、桑枝中總黃酮的提取方法主要有有機(jī)溶劑提取法、微波輔助提取法、超聲波提取法、酶提取法、超臨界流體萃取法、半仿生提取法等［11］。目前，關(guān)于提取桑葉桑枝中總黃酮的文獻(xiàn)很多。

1.2.1.1桑葉中總黃酮提取方法

超臨界流體萃取利用了超臨界流體在臨界壓力和臨界溫度的附近所具有的獨(dú)特性能，以此性能作為溶劑萃取物質(zhì)的一種新技術(shù)。肖奇志［12］采用超臨界CO2的方法萃取桑葉中總黃酮，獲取最佳萃取工藝為：壓力35MPa，夾帶劑乙醇流量0.01mL/min，溫度為55℃，乙醇質(zhì)量分?jǐn)?shù)90%，得總黃酮萃取率達(dá)2.28%。林英男［13］用同樣的方法提取桑葉中的總黃酮，但改變了工藝條件，在萃取壓力為30MPa，萃取溫度為40℃，萃取時(shí)間為3.0h，夾帶劑無(wú)水乙醇用量為4.0mL/g的條件下進(jìn)行驗(yàn)證試驗(yàn)，黃酮得率達(dá)到3.2%。兩種方法大致相同，但實(shí)驗(yàn)結(jié)果卻不同，筆者認(rèn)為桑品種的不同、產(chǎn)地條件的不同，其桑葉中所含的總黃酮量也可能不一樣。超聲波提取法采用的是超聲波輔助溶劑進(jìn)行提取，聲波產(chǎn)生了高速、強(qiáng)烈的空化效應(yīng)和攪拌的作用，快速破壞植物的細(xì)胞，使溶劑能夠滲透到藥材細(xì)胞中，縮短提取時(shí)間，提高提取效率。蘭才［14］在總黃酮提取工藝的研究中表明與煎煮法、回流法相比，超聲波提取法提取率最高，得出桑葉總黃酮提取的最佳條件為：約0.500g樣品用40mL體積分?jǐn)?shù)為70%的乙醇水溶液充分浸泡后，超聲波輔助提取45min，平均提取率為3.3%。

1.2.1.2桑枝中總黃酮提取方法

何雪梅等［15］采用二次回歸正交旋轉(zhuǎn)組合設(shè)計(jì)獲得最佳提取桑枝中總黃酮的工藝條件為：溫度80℃，時(shí)間為3.5h，乙醇濃度60%，料液比1∶40，獲得總黃酮率為0.63%；陳建明［16］采用正交試驗(yàn)的方法對(duì)桑枝總黃酮超聲提取的工藝進(jìn)行研究，獲得最佳工藝條件為：乙醇濃度為80%，料液比為1∶8，超聲反復(fù)提取3次，每次提取時(shí)間為20min，此方法獲得總黃酮的平均提取率為0.719%，提取率高于前者，可見(jiàn)經(jīng)過(guò)超聲處理能較好地提取桑枝中的總黃酮，其操作方便、提取時(shí)間短、產(chǎn)率高而且無(wú)需加熱。目前，關(guān)于桑枝中總黃酮的提取方法的研究報(bào)道明顯少于桑葉總黃酮的提取方法，原因可能與桑枝含大量木質(zhì)和纖維不容易粉碎處理有關(guān)。

1.3桑樹(shù)幾種主要黃酮類化合物

1.3.1槲皮素

槲皮素廣泛存在于植物的花、葉、果實(shí)中，是一種具有多種生物學(xué)活性的黃酮類化合物，已知有100多種中草藥中含有槲皮素，如桑樹(shù)的枝、葉、果實(shí)，菊花、絞股藍(lán)、山楂、銀杏葉、雞冠花、魚(yú)腥草［17］。槲皮素具有抗氧化和清除自由基、抗纖維化、抗腫瘤等作用，此外還對(duì)心血管系統(tǒng)具有降血壓、保護(hù)心肌缺血、再灌注損傷、抑制心肌肥厚和抗病毒等作用。王海燕［18］利用超聲波輔助的方法提取桑葉中槲皮素獲得了最優(yōu)工藝條件為：乙醇體積分?jǐn)?shù)為51%、液料比26∶1（mL/g）、超聲功率為200W、超聲溫度70℃，可以得到桑葉槲皮素提取量為11.13mg/g。由此可見(jiàn)，槲皮素在桑葉中的含量還是相當(dāng)可觀的，可以利用桑葉為原材料開(kāi)發(fā)有關(guān)槲皮素方面的藥品。

1.3.2花青素

花青素，由一定數(shù)量的兒茶素、表兒茶素縮合而成，屬于酚類化合物中的類黃酮類化合物，溶于水。花青素是植物體內(nèi)一類次生代謝物質(zhì)，存在于植物花瓣、果實(shí)的細(xì)胞液組織及莖葉的表面細(xì)胞中［19］，具有延緩衰老等作用。江巖［20］對(duì)新疆藥桑椹花青素做了提取和測(cè)定，獲得藥桑椹花青素的最佳提取工藝：溶劑體積比為0.1%的HCl溶液和95%的乙醇為40∶60、固液比為1∶20（g/mL），提取溫度為50℃，提取時(shí)間為90min，在這種條件下花青素得率為0.0305%。此實(shí)驗(yàn)獲得的花青素得率比較少，是藥桑品種的桑椹花青素特別少，還是提取桑椹中花青素的問(wèn)題，有待繼續(xù)研究。

1.3.3桑色素

桑色素是一種天然的活性物質(zhì)，主要有抗癌、抗炎、免疫、抗氧化等作用。存在于桑的葉、根皮和果實(shí)中［21］，李文娟［22］用AB-8型大孔吸附樹(shù)脂對(duì)新疆藥桑進(jìn)行分離純化，獲得新疆藥桑最佳提取條件：用0.1%的HCl-C2H5OH溶液，按1∶5的配比在溫度為40℃時(shí)提取1h。經(jīng)此方法純化后的色素為紫紅色的粉末，色價(jià)提高近7倍之多。

2桑葉、桑枝多糖的提取方法

2.1桑葉多糖的提取方法

多糖是極性大分子物質(zhì)，國(guó)內(nèi)外研究證明，植物、動(dòng)物及菌類中均含有天然多糖，具有降血糖、降血脂、消除自由基、抗腫瘤、抑制細(xì)菌生長(zhǎng)及增強(qiáng)免疫力等功能［23］。桑葉多糖是一種較為常見(jiàn)的生物多糖，中國(guó)是桑葉主要產(chǎn)地，大約有83萬(wàn)hm2的種植面積，年產(chǎn)桑葉1500多萬(wàn)t，提取桑葉多糖的原料十分豐富。目前，對(duì)于桑葉多糖的提取主要有熱水浸提法、酸浸提法、堿浸提法、酶提取法、超聲波提取法及微波提取法等。熱水浸提法是以水作為提取劑，無(wú)污染且對(duì)多糖結(jié)構(gòu)不易造成破壞，但是需要反復(fù)提取多次，提取時(shí)間久且提取率不高。沈愛(ài)英［24］經(jīng)正交實(shí)驗(yàn)得出最佳桑葉多糖提取條件：桑葉粉質(zhì)量濃度為0.040g/mL，75℃水浴中抽提2次，每次60min，用80%（終體積分?jǐn)?shù)）乙醇醇析，此方法測(cè)得多糖得率為2.508%。酸堿提取由于提取液為酸性或堿性容易破壞多糖的立體結(jié)構(gòu)，而且提取后還需綜合其pH，程序復(fù)雜，多不為采用。酶提取法即采用熱水浸提法的同時(shí)加入酶的提取方法，目前酶提取法有單一酶法、復(fù)合酶法和分別酶法。所采用的酶一般為果膠酶、纖維素酶和中性蛋白酶等［25］。夏平等［26］用纖維素酶∶果膠酶＝1∶1的方法提取桑葉中的多糖得到最佳工藝為：溫度50℃、pH4.5，酶用量1.0%，提取1h，提取率為14.32%。此方法對(duì)桑葉中的活性物質(zhì)影響較小，且實(shí)驗(yàn)快速。趙俊等［27］發(fā)現(xiàn)超聲波提取法的產(chǎn)量明顯多于水煎煮，且用時(shí)少、提取的次數(shù)也少于水煎煮法，所以使用超聲波法提取桑葉多糖值得推廣。黃山等［28］用微波法提取桑葉多糖，獲得的最佳工藝條件：料液比1∶25，溶劑pH8.0，微波功率為300W，微波處理10min，多糖得率為4.26%，比熱水浸提法的得率提高了18.99%［29］。此方法應(yīng)用于植物細(xì)胞破壁，可以使目的物的回收率提高。

2.2桑枝多糖的提取方法

桑枝是養(yǎng)蠶業(yè)的副產(chǎn)物，是一種傳統(tǒng)的中藥，臨床上主要用于關(guān)節(jié)腫痛、手足麻木、風(fēng)濕痹痛、癱瘓等多種疾病的治療［30］。現(xiàn)代研究表明，桑枝多糖具有降血糖、提高免疫力、抗氧化等藥理活性［31］。因此，從桑枝中提取桑多糖對(duì)桑資源利用具有重要的意義。費(fèi)建明等［32］研究了一般提取法、微波提取法、超聲波提取法和生物酶提取法等多種提取桑枝多糖的方法。確定了一般提取法中的最佳條件：以沸水為提取劑，溶液與材料比為20倍，提取時(shí)間為100min，pH5，獲得最高提取率為16.82%，平均提取率為14.54%。用桑枝一般提取法中最佳的提取條件，中間增加間隔微波處理，采用正交試驗(yàn)法，對(duì)功率、時(shí)間比例和微波次數(shù)這三個(gè)因素設(shè)置三個(gè)水平試驗(yàn)，獲得微波提取的最適條件：微波功率500W，3次微波處理，微波時(shí)間為總提取時(shí)間的60%，獲得最高提取率為17.22%，平均提取率為15.15%，比一般提取法的最高提取率和平均提取率均有所提高。超聲波提取法與微波提取法的處理方法基本一致，用同樣的三個(gè)因素設(shè)置三個(gè)水平因素獲得最佳超聲波功率為120W，獲得最高提取率為17.37%，平均提取率為15.27%，同樣比一般提取法提取率高。果膠酶提取法獲得的最高提取率為18.26%，平均提取率17.24，提取率高于以上3種提取方法。

3桑葉、桑枝中生物堿類物質(zhì)

3.1桑葉、桑枝中生物堿類化合物種類

桑生物堿具有良好的降血糖、降血脂、抗病毒、提高免疫力、抗衰老等藥理作用［33］。多羥基生物堿及其苷類化合物集中在桑屬植物的親水性較強(qiáng)部位，常與氨基酸、甜菜堿等其他化合物共存。根據(jù)化合物結(jié)構(gòu)特點(diǎn)，又可分為多羥基哌啶類、多羥基吡咯烷類和多羥基降托品烷類［34］。1-脫氧野尻霉素（DNJ）是桑樹(shù)中的一種生物堿，首先是由Inoue等作為抗生素從鏈霉菌中提取得到，由野尻霉素氫化而來(lái)。Yoshiaki從桑中分離出DNJ［35］，桑葉中含量為0.11%［36］。DNJ為桑的特有物質(zhì)，其他植物中也含有，如HangSubkim等［37］從野跖草中分離并鑒定出了DNJ，但其DNJ含量只有0.01125%。Asano等［38］從風(fēng)信子鱗莖利用甲醇提取物中分離到DNJ，含量也只為0.0012%。可見(jiàn)桑樹(shù)的DNJ含量遠(yuǎn)高于其他植物，DNJ是桑樹(shù)生物堿特征性、標(biāo)志性的生物堿。現(xiàn)代藥理實(shí)驗(yàn)證明DNJ在治療糖尿病和抗菌消炎等方面具有良好的作用。有相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道，糖尿病已經(jīng)成為僅次于心血管病、癌癥的第三大類導(dǎo)致人類死亡的疾病，具有高致死率、高致殘率和高醫(yī)療花費(fèi)的特征。世衛(wèi)組織表明全球糖尿病患者已超過(guò)4億人，而且數(shù)目呈增長(zhǎng)趨勢(shì)。中國(guó)糖尿病患者人數(shù)達(dá)9700萬(wàn)以上，數(shù)量為世界第一。糖尿病早已成為當(dāng)前世界各國(guó)共同面對(duì)的公共健康問(wèn)題，DNJ又具有明顯的抑制食后血糖急劇升高、延緩糖尿病的發(fā)作和惡化等作用，所以對(duì)于DNJ的藥理學(xué)研究已經(jīng)相當(dāng)?shù)亩唷５牵Ｈ~中DNJ的含量非常少，所以選取提取率高、簡(jiǎn)單、快速、操作成本低的提取方法，將為以后的桑葉綜合利用、開(kāi)發(fā)研制降血糖藥品和保健食品提供良好的技術(shù)支持。

3.2桑葉、桑枝中生物堿類物質(zhì)的提取方法

3.2.1桑葉、桑枝中總生物堿的提取方法

天然有機(jī)化合物的提取方法可分為經(jīng)典提取方法和現(xiàn)代提取方法兩種。經(jīng)典提取方法不需要特殊的儀器，簡(jiǎn)單、易操作，可降低提取成本，主要包括溶劑提取法、水蒸氣蒸餾法、分子蒸餾法等。其中，溶劑提取法又包括煎煮法、浸漬法、滲漉法、回流提取法、連續(xù)提取法等。現(xiàn)代提取方法是以現(xiàn)代先進(jìn)的儀器為基礎(chǔ)或新發(fā)展起來(lái)的提取方法，主要包括超臨界流體萃取法、超聲波提取法、微波提取法、仿生提取法、酶法提取法、加壓逆流提取法、固相微萃取法等。其優(yōu)點(diǎn)在于縮短了天然產(chǎn)物有效成分的提取時(shí)間，同時(shí)提高提取效率，但又因這些提取方法大多需要先進(jìn)的儀器或嚴(yán)格的操作技術(shù)，所以普及程度不高。桑中總生物堿提取的常見(jiàn)方法主要有溶劑法、離子交換樹(shù)脂法、大孔吸附樹(shù)脂法、滲漉—薄膜蒸發(fā)連續(xù)提取法和超臨界流體萃取法等。劉凡等［39］測(cè)定98份不同桑樹(shù)品種中總生物堿含量，所用方法為：稱取桑葉粉2.000g，提取液為25%乙醇和-0.05mol/L鹽酸，原料質(zhì)量濃度為0.050g/mL，常溫浸提3h，次數(shù)為2次，過(guò)濾，合并提取液后濃縮，用HPD-100大孔樹(shù)脂過(guò)柱，純水進(jìn)行洗脫，洗脫液進(jìn)行減壓濃縮，以4-羥基哌啶醇為標(biāo)準(zhǔn)物，采用雷氏鹽比色法測(cè)定桑葉中的總生物堿的含量，測(cè)得結(jié)果表明多數(shù)品種的桑葉總生物堿質(zhì)量比分布在1.50~3.00mg/g之間。劉一衡等［40］使用優(yōu)化超聲法提取新疆藥桑桑葉總生物堿，獲得提取的優(yōu)化工藝條件為：提取時(shí)間20min，溫度60℃，料液比1∶20（g/mL），超聲功率為800W，乙醇濃度為60%。在這種條件下，獲得新疆藥桑桑葉總生物堿含量為4.64mg/g。此種方法獲得生物堿比較高，其他桑品種在提取總生物堿時(shí)多有借用。

3.2.2桑樹(shù)生物堿特征成分1-脫氧野尻霉素（DNJ）的提取方法

DNJ的提取方法比較傳統(tǒng)的有蒸餾水提取法、酸提取法、有機(jī)溶劑提取法等，隨著科技的進(jìn)步、實(shí)驗(yàn)儀器的發(fā)展，可在這些傳統(tǒng)方法上施以超聲波、微波等處理，則又有了超聲波提取法和微波提取法等。劉樹(shù)興等［41］利用水提法經(jīng)工藝優(yōu)化后獲得最佳提取方案：固液比1∶40，溫度80℃，時(shí)間為2.5h。蒸餾水提取很難過(guò)濾桑樹(shù)中含有的一些果膠等成分，而且用時(shí)多，提取率低，所以現(xiàn)在很少使用。馬靜［42］利用酸水解法和有機(jī)溶劑提取法相結(jié)合的方法獲得最佳的工藝條件：桑葉粉末粒度為60目，提取溫度為55℃，pH1的50%乙醇溶液，提取時(shí)間為1.5h，獲得DNJ的得率為0.062%。此實(shí)驗(yàn)的提取時(shí)間有所減少，但是提取量還不理想。花俊麗等［43］利用超聲波強(qiáng)化法獲得最佳工藝條件：超聲功率125W，每克桑葉浸提劑用量為40mL，超聲時(shí)所用溫度為70℃，超聲時(shí)間為20min，獲得DNJ的得率為0.091%。有文獻(xiàn)表明，微波提取較水蒸氣蒸餾、索氏提取等傳統(tǒng)的中藥提取方法，以及超臨界提取、超聲提取、加速溶劑提取等手段具有一定優(yōu)勢(shì)，表現(xiàn)在提取率高，顯示出廣闊的應(yīng)用前景［44］。胡瑞君等［45］利用微波輔助提取技術(shù)獲得最佳實(shí)驗(yàn)條件：微波功率406W、處理時(shí)間1.5min，固液比為1∶40，提取2次，提取率為0.024%。

4總結(jié)

4.1優(yōu)選原料

桑葉、桑枝、桑果含有黃酮類、多糖、生物堿類物質(zhì)等重要活性成分，但是否具有產(chǎn)業(yè)化開(kāi)發(fā)利用的商業(yè)價(jià)值和市場(chǎng)前景，主要取決于原料來(lái)源、價(jià)格和提取率。廣西是我國(guó)最大的蠶桑生產(chǎn)省區(qū)，桑葉、桑枝資源豐富，但桑葉中總黃酮、總生物堿含量均小于3.00mg/g。因此，用桑葉提取黃酮類、生物堿類、多糖類物質(zhì)等活性物質(zhì)的成本很高，難以產(chǎn)業(yè)化。桑枝為養(yǎng)蠶的副產(chǎn)物，收獲、干燥、運(yùn)輸和貯存較為方便，以桑枝為原料提取黃酮類、生物堿類、多糖類物質(zhì)等活性物質(zhì)的成本較低，有利于產(chǎn)業(yè)化開(kāi)發(fā)。不同桑品種、不同產(chǎn)地、不同季節(jié)和生長(zhǎng)時(shí)間的桑枝原料，其活性成分含量有較大差異，研究比較蠶桑產(chǎn)區(qū)現(xiàn)有桑品種、不同季節(jié)和生長(zhǎng)時(shí)間的桑枝原料中活性成分含量，以評(píng)估優(yōu)選原料。

4.2綜合利用，優(yōu)化工藝

桑樹(shù)活性物質(zhì)提取和產(chǎn)業(yè)化開(kāi)發(fā)，應(yīng)以高效、節(jié)能、環(huán)保、安全、多用、高值為目標(biāo)，科學(xué)設(shè)計(jì)技術(shù)路線，優(yōu)化生產(chǎn)工藝，實(shí)現(xiàn)同一原料提取多種活性物質(zhì)，開(kāi)發(fā)多種健康產(chǎn)品，廢渣、廢液循環(huán)利用，以提高綜合經(jīng)濟(jì)效益。

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作者:陶程 朱方容 李秋捷 彭夢(mèng)媛 陳慧珠 屈達(dá)才 單位:廣西大學(xué)農(nóng)學(xué)院 廣西壯族自治區(qū)蠶業(yè)科學(xué)研究院