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《農(nóng)產(chǎn)品加工雜志》2015年第六期

1材料與方法

1.1試驗(yàn)材料

1.1.1材料與試劑甜蕎麥，購(gòu)于陜西省榆林市；糖化酶（酶活力50000U/g），蘇柯漢（濰坊）生物工程有限公司產(chǎn)品；安琪釀酒高活力干酵母，安琪酵母股份有限公司產(chǎn)品；丹寶利釀酒高活性干酵母，廣東丹寶利酵母有限公司產(chǎn)品；奧力釀酒干酵母，珠海紫英生物科技有限公司產(chǎn)品；天香苑高活性酒用干酵母，珠海天香苑生物科技發(fā)展有限公司產(chǎn)品。所用試劑為實(shí)驗(yàn)室常用試劑。

1.1.2儀器設(shè)備SHIMADZU型電子天平，Uni-Bio公司產(chǎn)品；KQ-700GVDV型三頻恒溫?cái)?shù)控超聲波清洗器，江蘇省昆山市超聲波儀器有限公司產(chǎn)品；FW177型粉碎機(jī)，天津市泰斯特儀器有限公司產(chǎn)品；SHB-Ⅲ型循環(huán)水式多用真空泵，鄭州長(zhǎng)城科工貿(mào)有限公司產(chǎn)品；HH-60型數(shù)顯恒溫?cái)嚢柩h(huán)水箱，北京國(guó)華醫(yī)療器械廠產(chǎn)品。

1.2試驗(yàn)方法

1.2.1活力干酵母活化按照1∶1∶10的比例，將釀酒高活性干酵母、白砂糖和蒸餾水配制成懸浮液，在30℃，150r/min下?lián)u床中振蕩活化30min，混合液中會(huì)出現(xiàn)大量的小氣泡。

1.2.2釀酒酵母耐抗性研究根據(jù)實(shí)驗(yàn)室前期研究結(jié)果，對(duì)蕎麥粉進(jìn)行糖化處理，然后調(diào)整糊化液中糖濃度，將4株釀酒酵母接種，分別評(píng)價(jià)其耐糖性、耐乙醇能力及耐SO2的能力。（1）酵母菌株耐高糖特性測(cè)定。白砂糖調(diào)整蕎麥糊化液體系的糖度分別為17%，20%，23%，26%和29%，檸檬酸調(diào)節(jié)體系pH值為4.0，分裝、滅菌。分別接種200μL活化的酵母菌液（菌體濃度1×106CFU/mL），30℃條件下恒溫培養(yǎng)48h。對(duì)培養(yǎng)液1×10倍梯度稀釋?zhuān)迫?00μL涂布于YPD固體培養(yǎng)基上，培養(yǎng)、計(jì)數(shù)，記錄不同處理樣品的菌落數(shù)，評(píng)價(jià)各酵母菌株的耐糖性。（2）酵母菌株耐乙醇的測(cè)定。用白砂糖和檸檬酸調(diào)整蕎麥糊化液體系的糖度和pH值為20%和4.0，每瓶分裝100mL，滅菌。各瓶添加一定量的無(wú)水乙醇，使其乙醇體積分?jǐn)?shù)分別為0，7%，10%，13%，16%，接種200μL活化的酵母菌液（菌體濃度1×106CFU/mL），30℃條件下恒溫培養(yǎng)48h。對(duì)培養(yǎng)液10倍梯度稀釋?zhuān)迫?00μL涂布于YPD固體培養(yǎng)基上，培養(yǎng)、計(jì)數(shù)，記錄不同處理樣品的菌落數(shù)，評(píng)價(jià)各酵母菌株的乙醇抗性。（3）酵母菌株耐SO2的測(cè)定。用白砂糖和檸檬酸調(diào)整蕎麥糊化液體系的糖度和pH值為20%和4.0，每瓶分裝100mL，滅菌。各瓶添加一定量的亞硫酸，使其SO2質(zhì)量濃度分別達(dá)到0，60，100，300，500，700mg/L，接種200μL活化的酵母菌液（菌體濃度1×106CFU/mL），30℃條件下恒溫培養(yǎng)48h。對(duì)培養(yǎng)液10倍梯度稀釋?zhuān)迫?00μL涂布于YPD固體培養(yǎng)基上，培養(yǎng)、計(jì)數(shù)，記錄不同處理樣品的菌落數(shù)，評(píng)價(jià)各酵母菌株對(duì)SO2的耐受性。

1.2.3釀酒酵母發(fā)酵特性研究（1）CO2失質(zhì)量的測(cè)定。用白砂糖和檸檬酸調(diào)整蕎麥糊化液體系的糖度和pH值為20%和4.0，每瓶分裝100mL，滅菌。每瓶接種200μL活化的酵母菌液（菌體濃度1×106CFU/mL），30℃條件下恒溫培養(yǎng)，每12h秤質(zhì)量1次，做好記錄，根據(jù)CO2失質(zhì)量繪制各酵母菌株的發(fā)酵特性曲線。（2）發(fā)酵酒精度測(cè)定。標(biāo)準(zhǔn)曲線：在樣品測(cè)定中，用水和無(wú)水乙醇配制成已知酒度的梯度溶液進(jìn)行氣相色譜法檢測(cè)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。樣品測(cè)定：發(fā)酵結(jié)束后，對(duì)發(fā)酵酒樣進(jìn)行1∶1稀釋?zhuān)缓蠼?jīng)0.45μm濾膜過(guò)濾并采用氣相色譜法檢測(cè)，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算發(fā)酵樣品的酒精度。檢測(cè)方法：發(fā)酵樣品中酒精度的測(cè)定采用氣相色譜法，具體條件為PorapakN色譜柱，3m×3mm；柱溫190℃，進(jìn)樣口溫度220℃，F(xiàn)ID檢測(cè)器溫度250℃；空氣壓強(qiáng)50kPa，載氣N2壓強(qiáng)50kPa，H2壓強(qiáng)70kPa。（3）理化指標(biāo)測(cè)定及感官品質(zhì)特性分析。用白砂糖和檸檬酸調(diào)整蕎麥糊化液體系的糖度和pH值為20%和4.0，每瓶分裝100mL，滅菌。每瓶接種200μL活化的酵母菌液（菌體濃度1×106CFU/mL），30℃條件下恒溫培養(yǎng)。發(fā)酵結(jié)束后，測(cè)定發(fā)酵液中的還原糖、滴定酸、總黃酮含量及pH值，比較不同酵母菌對(duì)發(fā)酵液理化性能的影響，并對(duì)發(fā)酵產(chǎn)品進(jìn)行感官評(píng)價(jià)。其中，還原糖（以葡萄糖計(jì)）的測(cè)定采用斐林試劑法；滴定酸（以乙酸計(jì)）的測(cè)定采用酸堿中和滴定法；總黃酮的測(cè)定采用比色法；pH值的測(cè)定采用pH計(jì)。感官評(píng)價(jià)方法參照GB/T15038與GB/T10220—2012相關(guān)內(nèi)容，以4株供試菌株發(fā)酵獲得的蕎麥保健酒為感官評(píng)價(jià)對(duì)象，以培訓(xùn)篩選的12名研究生（男性5名、女性7名）為感官評(píng)定員，從色澤、澄清度、香氣、滋味、典型性等5個(gè)方面對(duì)發(fā)酵獲得的產(chǎn)品進(jìn)行綜合評(píng)價(jià)和打分，并去掉一個(gè)最高分和一個(gè)最低分，求取平均值即為最終感官評(píng)價(jià)評(píng)分。感官評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)見(jiàn)表1。

2結(jié)果與分析

2.1釀酒酵母抗性試驗(yàn)（1）釀酒酵母耐糖性的比較。在釀酒過(guò)程中，釀酒酵母的主要作用是以葡萄糖為底物，轉(zhuǎn)化獲得乙醇。因此，適宜的葡萄糖質(zhì)量濃度是保證果酒發(fā)酵效果的重要指標(biāo)，釀酒酵母的耐糖性是果酒順利發(fā)酵生產(chǎn)的關(guān)鍵參數(shù)。因此，本研究對(duì)4個(gè)供試菌株的耐糖性能進(jìn)行評(píng)價(jià)。由表2可知，4個(gè)供試菌株均可耐受290g/L的糖質(zhì)量濃度，具有較高的耐糖性。隨著糖質(zhì)量濃度的不斷增大，各菌株的菌落數(shù)并沒(méi)有大幅減少，其菌落數(shù)都保持在一個(gè)數(shù)量級(jí)。在糖質(zhì)量濃度增大至290g/L時(shí)，奧力酵母菌株的耐糖性最強(qiáng)，其菌落數(shù)為3.90×107CFU/mL，其余依次為丹寶利酵母和安琪酵母，天香苑酵母的耐糖性相對(duì)較弱，但是菌落數(shù)也達(dá)到了1.03×107CFU/mL。（2）釀酒酵母耐乙醇能力的比較。釀酒酵母是生物乙醇和釀酒業(yè)發(fā)酵的關(guān)鍵菌株，具有發(fā)酵速度快、乙醇產(chǎn)量高的特性。然而，發(fā)酵過(guò)程中乙醇積累造成的毒性效應(yīng)又是限制乙醇產(chǎn)量的主要因素之一。因此，釀酒酵母的乙醇耐受能力是其用于發(fā)酵釀酒的關(guān)鍵指標(biāo)。本研究中對(duì)4個(gè)供試菌株的乙醇耐受能力進(jìn)行評(píng)價(jià)。由表3可知，乙醇對(duì)酵母菌株的生長(zhǎng)具有明顯的抑制作用，隨著乙醇體積分?jǐn)?shù)的提高，菌落數(shù)明顯減少。4個(gè)供試菌株均可耐受16%的乙醇，且至少保持100個(gè)可培養(yǎng)菌落。同時(shí)，4個(gè)供試菌株中，安琪酵母菌株的乙醇耐受能力最強(qiáng)，其在16%乙醇體積分?jǐn)?shù)下的存活數(shù)是5.90×102CFU/mL；天香苑酵母菌株的乙醇耐受能力相對(duì)較弱，相同條件下存活數(shù)僅為1.30×102CFU/mL菌落生長(zhǎng)。（3）釀酒酵母耐二氧化硫（SO2）能力的比較。不同微生物對(duì)SO2的敏感性差異較大，其中細(xì)菌最為敏感，其次是尖端酵母，而釀酒酵母對(duì)SO2的耐受能力較強(qiáng)。在蕎麥保健酒釀造過(guò)程中，添加適量的SO2，不但具有抑菌、抗氧化、改善果酒風(fēng)味和增酸等作用，還可以減少其他微生物對(duì)釀酒酵母的影響，保證發(fā)酵過(guò)程順利完成，并防止貯藏中果酒的二次發(fā)酵和腐敗。但是高質(zhì)量濃度的SO2，不但會(huì)引起人體健康問(wèn)題，還會(huì)抑制酵母生長(zhǎng)和發(fā)酵，不能保證蕎麥保健酒發(fā)酵順利完成。因此，本研究中對(duì)4個(gè)供試菌株的SO2耐受能力進(jìn)行評(píng)價(jià)。由表4可知，SO2添加量對(duì)4株釀酒酵母的抑制作用較弱，隨著SO2質(zhì)量濃度的增大，不同酵母的菌落數(shù)并沒(méi)有明顯的減少；所有供試菌株均可耐受500mg/L的SO2質(zhì)量濃度并至少保持1×107CFU/mL菌落生長(zhǎng)。在SO2質(zhì)量濃度增大至500mg/L時(shí)，丹寶利酵母菌株的耐受能力最強(qiáng)，其菌落數(shù)為2.19×108CFU/mL，其次為奧力酵母、天香苑酵母，安琪酵母菌株對(duì)SO2的耐受能力相對(duì)最弱，其菌落數(shù)為2.61×107CFU/mL。結(jié)果表明，4株釀酒酵母均具有比較好的耐乙醇能力、耐SO2能力以及耐糖性，可以用于蕎麥保健酒的釀制生產(chǎn)。

2.2釀酒酵母發(fā)酵特性研究（1）釀酒酵母發(fā)酵特性。釀酒酵母的發(fā)酵特性是蕎麥保健酒釀制的關(guān)鍵，評(píng)價(jià)獲得各菌株發(fā)酵過(guò)程中基礎(chǔ)數(shù)據(jù)對(duì)調(diào)控蕎麥酒的釀制過(guò)程具有非常重要的影響。本研究中4株釀酒酵母的發(fā)酵性能以CO2失質(zhì)量為基本評(píng)價(jià)指標(biāo)。由圖1可知，起始發(fā)酵的前24h，安琪酵母菌株和丹寶利酵母菌株發(fā)酵最快，CO2失質(zhì)量最多，天香苑酵母菌株發(fā)酵最慢，CO2失質(zhì)量最少，奧力酵母菌株介于中間，且CO2失質(zhì)量基本相同；前72h（3d），基本維持這一趨勢(shì)。第4天開(kāi)始，天香苑酵母菌株發(fā)酵速度加快，CO2失質(zhì)量逐漸增大，奧力酵母菌株發(fā)酵速度依然較慢，其CO2失質(zhì)量最小，這一發(fā)酵狀態(tài)一直持續(xù)到144h（6d）；第7天開(kāi)始，奧力酵母菌株的CO2失質(zhì)量逐漸超過(guò)天香苑酵母菌株，且安琪酵母和丹寶利酵母菌株的CO2失質(zhì)量依然為最大，奧力酵母菌株和天香苑酵母菌株的CO2失質(zhì)量基本相同，這一發(fā)酵趨勢(shì)一直持續(xù)到216h（9d）發(fā)酵結(jié)束。結(jié)果表明，在發(fā)酵過(guò)程中，4株釀酒酵母的發(fā)酵速率略有差異，發(fā)酵產(chǎn)生的酒精度不同，但發(fā)酵結(jié)束后CO2總失質(zhì)量差異不大。由圖2可知，在發(fā)酵過(guò)程中，安琪酵母菌株發(fā)酵產(chǎn)物中酒精度最高（10.56%），其次為丹寶利酵母菌株（10.36%），天香苑酵母菌株發(fā)酵產(chǎn)生的酒精度最低（9.77%）。結(jié)果表明，4株釀酒酵母均具有比較好的產(chǎn)酒精能力。（2）不同酵母菌發(fā)酵酒成分研究。以4株釀酒酵母進(jìn)行蕎麥保健酒的發(fā)酵，發(fā)酵結(jié)束后分別測(cè)定發(fā)酵液中的還原糖、滴定酸、總黃酮含量及pH值。不同酵母菌發(fā)酵液成分比較見(jiàn)表5。由表5可知，4株釀酒酵母對(duì)發(fā)酵液中還原糖消耗有一定差別，其中安琪酵母和丹寶利酵母的降糖能力較強(qiáng)，均小于5.0，而奧力酵母和天香苑酵母發(fā)酵液中還原糖含量分別為5.26g/100mL和5.18g/100mL，表明這2株釀酒酵母的降糖能力較弱。4株釀酒酵母發(fā)酵液中有機(jī)酸含量均比較低，介于1.25~1.89g/L。而安琪酵母發(fā)酵液中總黃酮含量最大為126.31mg/L，其次為奧力酵母和丹寶利酵母，天香苑酵母發(fā)酵液中總黃酮含量最小，為110.65mg/L。同時(shí)，pH值變化越小越有利于酵母菌的生長(zhǎng)代謝，在本研究中，4株釀酒酵母發(fā)酵液中pH值介于3.75~3.91，降低幅度不大。（4）感官品質(zhì)特性分析。以各釀酒酵母菌株發(fā)酵制備蕎麥保健酒。通過(guò)對(duì)不同釀酒酵母菌株發(fā)酵的發(fā)酵結(jié)果可以看出，不同釀酒酵母發(fā)酵的蕎麥保健酒在色澤、澄清度、香氣、滋味和典型性方面具有較大的差異。不同釀酒酵母對(duì)蕎麥保健酒最終香氣、滋味以及特征性上具有較明顯的影響，其中安琪酵母發(fā)酵酒樣的香氣、滋味等方面相較其他酵母發(fā)酵酒樣有較明顯優(yōu)勢(shì)。通過(guò)感官評(píng)定結(jié)果可看出，安琪酵母發(fā)酵獲得的蕎麥保健酒具有更好的品質(zhì)。綜合不同釀酒酵母發(fā)酵蕎麥保健酒理化成分分析及感官評(píng)定結(jié)果，最終選擇安琪酵母為蕎麥保健酒的發(fā)酵菌株。

3結(jié)論

本研究以安琪酵母、丹寶利酵母、奧力酵母和天香苑酵母4株釀酒酵母為供試材料，對(duì)其耐糖性、耐乙醇能力及耐SO2能力進(jìn)行評(píng)價(jià)，并以CO2失質(zhì)量為評(píng)價(jià)指標(biāo)，繪制了不同釀酒酵母發(fā)酵的生長(zhǎng)曲線。同時(shí)，測(cè)定了4株釀酒酵母發(fā)酵獲得酒樣的還原糖、滴定酸、總黃酮含量及pH值，并對(duì)其進(jìn)行感官評(píng)價(jià)。結(jié)果表明，4株釀酒酵母均具有比較好的耐糖性、耐乙醇能力及耐SO2能力，4株釀酒酵母均具有比較好的產(chǎn)酒精能力，可以用于蕎麥保健酒釀制生產(chǎn)。同時(shí)，酒樣理化指標(biāo)和感官評(píng)價(jià)綜合分析表明，安琪酵母發(fā)酵酒樣的香氣、滋味等方面較其他酵母發(fā)酵酒樣有較明顯優(yōu)勢(shì)，以安琪酵母為供試菌株釀制的蕎麥保健酒具有更好的品質(zhì)。

作者：李陽(yáng)陽(yáng)徐懷德單位：西北農(nóng)林科技大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院定邊縣質(zhì)量技術(shù)監(jiān)督局