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摘要：

采用CodonW1．4．2軟件和CUSP程序，以普通羊肚菌全基因組蛋白質(zhì)編碼序列為對象，解析了該菌的有效密碼子數(shù)、密碼子3個位點的GC含量、相對同義密碼子使用度和高表達優(yōu)越密碼子。結(jié)果表明：普通羊肚菌全基因組密碼子第2位密碼子的GC含量明顯低于第1位和第3位，第3位密碼子與第1位含量差異不大，分別為57．8％和56．8％，RSCU值大于等于1的密碼子總共35個，其中以G或C結(jié)尾的25個，占71．4％，確定了25個高表達優(yōu)越密碼子。

關(guān)鍵詞：

普通羊肚菌；編碼序列；密碼子偏好性；優(yōu)越密碼子

生物界中大部分物種均采用標(biāo)準(zhǔn)的遺傳編碼系統(tǒng)進行蛋白質(zhì)翻譯，密碼子是生物體內(nèi)信息傳遞的基本單元，3個堿基組成的密碼子為基本的氨基酸翻譯單位，ATCG4種堿基共形成了64種不同的密碼子，在長期的物種進化過程中，形成了較為固定的起始密碼子ATG和3種終止密碼子TAA、TAG和TGA，除去3種終止密碼子后實際編碼氨基酸的密碼子共有61種，但是最終編碼的氨基酸只有20種，由此存在了密碼子冗余的現(xiàn)象，即一種氨基酸可由多種密碼子編碼，這些編碼相同氨基酸的密碼子稱之為同義密碼子。不同的物種編碼同種氨基酸所利用的密碼子種類不同，使用頻率也不同，這種現(xiàn)象稱為密碼子偏好性。最早關(guān)于密碼子偏好性的研究是1989年BONEKAMP發(fā)現(xiàn)大腸桿菌全基因組偏好性［1］。普通羊肚菌是著名的珍稀食藥用菌，味道鮮美，營養(yǎng)豐富，具有提神醒腦、補腎壯陽和抗腫瘤的功效［2－4］，筆者以普通羊肚菌全基因組蛋白質(zhì)編碼序列為對象，通過CodonW軟件和CUSP程序分析該菌的密碼子使用特征，為羊肚菌基因選擇合適的表達系統(tǒng)，優(yōu)化密碼子和提高基因表達量等奠定研究基礎(chǔ)。

1材料與方法

1．1標(biāo)本

普通羊肚菌（M．conica）于2015年5月采自云南省昆明市祿勸縣轎子山，標(biāo)本經(jīng)上海市農(nóng)業(yè)科學(xué)院轉(zhuǎn)基因環(huán)境安全評價實驗室提取基因組DNA，交由上海派森諾生物公司測序，并將ITS序列提交到NCBI網(wǎng)站進行BLAST比對后鑒定為普通羊肚菌。

1．2CDS獲得

將樣品的基因組DNA構(gòu)建400bp、700bpPairedEnd文庫和3000bp、10000bpMatepair文庫，運用讀長為2＊250bp的Miseq技術(shù)組裝文庫，SOAPdenovo軟件評價組裝結(jié)果。采用C語言編寫程 序剔除序列長度小于300bp（氨基酸數(shù)量小于100）CDS作為分析樣本［5］。

1．3密碼子偏性分析

采用CodonW1．4．2軟件分析CDS，獲得有效密碼子數(shù)，第1位、第2位和第3位堿基中GC含量以及相對同義密碼子使用度。根據(jù)ENC值對基因由大到小排序，抽取前后10％的基因分別作為樣本的高表達樣本組和低表達樣本組，分別計算各個密碼子的RSCU值，卡方檢驗確定高表達基因的優(yōu)越密碼子。

2結(jié)果與分析

2．1有效密碼子數(shù)與GC含量

獲得9676個CDS作為分析樣本，經(jīng)CodonW1．4．2軟件分析獲得全基因組共計9981條基因的4497467個密碼子，密碼子中不同位置GC含量不同，其中第2位的GC含量較低，為42％，第1位和第3位的GC含量差異較小，分別為57．8％和56．8％，GC平均含量為52．2％。

2．2ENC－plot曲線

ENC值是一個基因的密碼子使用頻率與同義密碼子平均使用頻率偏差的量化值。高表達基因的密碼子趨向于使用一種或幾種同義密碼子，偏愛程度越大，ENC值越小；反之，低表達基因含有的稀有密碼子種類多，偏好程度小，ENC值越大［6－7］。ENC－plot曲線是以ENC值為縱坐標(biāo)，密碼子第3位GC含量（GC3s）為橫坐標(biāo)，描述ENC與GC3s之間函數(shù)關(guān)系的曲線，能有效分析密碼子的偏好性，無選擇壓力下，表示ENC值的點應(yīng)落在曲線上。如果密碼子偏好主要受堿基組成的影響，ENC值則位于曲線附近；如果密碼子受選擇壓力的影響，偏好性顯著，相應(yīng)的點則位于曲線下方。曲線上方對應(yīng)的基因偏向于隨機使用密碼子［8］。在普通羊肚菌的全基因組中較少的基因位點分布在ENC－plot曲線上，大部分基因都不同程度的偏離曲線（圖1），表明少數(shù)基因的密碼子偏好性受基因的堿基組成影響，大部分基因在進化過程中受環(huán)境選擇壓力等其他因素的影響從而使密碼子的偏好性發(fā)生差異。

2．3相對同義密碼子使用度

RSCU值反映的是密碼子在編碼同義氨基酸間的相對概率，當(dāng)同義密碼子對應(yīng)氨基酸的使用頻率相同，則相對密碼子使用度就是1。當(dāng)密碼子的使用頻率相對較高時則相對密碼子使用度大于1（高頻密碼子），反之當(dāng)密碼子的使用頻率相對較低時則相對密碼子使用度小于1［9］。普通羊肚菌中RSCU值大于等于1的密碼子總共35個，其中以G或C結(jié)尾的25個，占71．4％；以A或T結(jié)尾的10個，占28．6％（表1）。

2．4優(yōu)越密碼子

經(jīng)分析確定了TTC、CTC和ATC等25個密碼子為普通羊肚菌的優(yōu)越密碼子，這些優(yōu)越密碼子將為外源基因在羊肚菌中的表達提供了編碼基因序列優(yōu)化的參考，也將顯著提高外源基因的表達水平和翻譯準(zhǔn)確率。

3討論

GC含量在同義密碼子使用偏好性的過程中具有重要的作用，密碼子偏好性強的基因使用G或C結(jié)尾密碼子的概率要大，第3位密碼子的變異往往是密碼子偏好性發(fā)生變化的決定性因素［10］。在物種長期進化過程中，環(huán)境和選擇壓力差異造成了不同的進化歷程，所以任何物種為適應(yīng)其特定的環(huán)境和基因組條件，都要形成自己特定的符合其基因組的密碼子使用法則。密碼子偏好性受多個因素的影響，如基因表達水平［11］、mRNA二級結(jié)構(gòu)［12］、翻譯效率［13］、基因的堿基組分［14］、基因長度［15－16］、二核苷酸的出現(xiàn)頻率［17］、RNA豐度［18］、編碼蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)和功能［19］及密碼子－反密碼子間結(jié)合能的大小［20］。在不存在自然選擇壓力的條件下，一定方向的突變壓力會造成基因編碼序列的堿基組成差異，同樣，這種突變壓力也會影響密碼子的第3位堿基種類［21］。在進化過程中，若A（T）到G（C）的突變壓力大，那么密碼子的第3位堿基是G（C）的概率就要高［22］。對于普通羊肚菌而言，密碼子的堿基組成中第3位堿基上GC含量為57．8％，高于A（T）的含量，說明與普通羊肚菌密碼子偏好性一致的物種在進化過程中A（T）到G（C）的突變壓力高于G（C）到A（T）的突變壓力。普通羊肚菌的優(yōu)越密碼子的確定對于今后羊肚菌轉(zhuǎn)基因過程中對構(gòu)建合適的轉(zhuǎn)基因表達系統(tǒng)具有重要的指導(dǎo)意義，針對普通羊肚菌所偏好的密碼子進行優(yōu)化改造目的基因，從而提高目的蛋白質(zhì)的表達量，同時為普通羊肚菌基因外源表達選擇適合的宿主提供重要基礎(chǔ)，為食藥用真菌的密碼子優(yōu)化建立參考模本。

參考文獻

［1］劉次全，謝君，柳樹群，等．人類基因中同義密碼子的偏好與密碼子—反密碼子間的結(jié)合強度密切相關(guān)嗎？［J］．科學(xué)通報，2000，45（23）：2520－2525．

［2］時慧，王玉，楊路成，等．茶樹抗寒調(diào)控轉(zhuǎn)錄因子ICE1密碼子偏性分析［J］．園藝學(xué)報，2012，39（7）：1341－1352．

作者：呂貝貝 吳瀟 蔣瑋 于海龍 金劍鋒 陳雷 譚琦 唐雪明 單位：上海市農(nóng)業(yè)科學(xué)院生物技術(shù)研究所 上海市農(nóng)業(yè)遺傳育種重點實驗室 上海市農(nóng)業(yè)科學(xué)院食用菌研究所 農(nóng)業(yè)部南方食用菌資源利用重點實驗室 國家食用菌工程技術(shù)研究中心 國家食用菌加工技術(shù)研發(fā)分中心 上海市農(nóng)業(yè)遺傳育種重點開放實驗室 上海市農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)業(yè)科技信息技術(shù)研究所 南京野生植物綜合利用研究院