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《解剖學(xué)報(bào)》2016年第二期

［摘要］

目的比較移植性腫瘤動(dòng)物模型與慢病毒介導(dǎo)的膠質(zhì)瘤模型在教學(xué)中的應(yīng)用效果。方法選取50名臨床8年制5年級(jí)學(xué)生，根據(jù)不同的實(shí)驗(yàn)操作，將學(xué)生隨機(jī)分為移植性腫瘤動(dòng)物模型組(n=25)以及慢病毒介導(dǎo)的膠質(zhì)瘤模型組(n=25)。移植性腫瘤動(dòng)物模型組以大鼠膠質(zhì)瘤細(xì)胞系9L腦紋狀體注射Wistar大鼠模型進(jìn)行實(shí)驗(yàn)操作;而慢病毒介導(dǎo)的膠質(zhì)瘤模型組則以慢病毒載體介導(dǎo)Ras的表達(dá)以及Akt的激活，注射膠質(zhì)纖維酸性蛋白(GFAP)-Cre基因小鼠進(jìn)行實(shí)驗(yàn)操作。教學(xué)結(jié)束后比較兩組的教學(xué)反饋和教學(xué)成果。結(jié)果與移植性腫瘤動(dòng)物模型組相比，慢病毒介導(dǎo)的膠質(zhì)瘤模型組成員對(duì)該模型的教學(xué)反饋評(píng)價(jià)更高，該模型的重復(fù)性更好，使學(xué)生對(duì)腫瘤分子水平的認(rèn)識(shí)更深入，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。結(jié)論慢病毒介導(dǎo)的膠質(zhì)瘤模型在教學(xué)中應(yīng)用具有可行性，不僅提供了一個(gè)較新的模型，也使得學(xué)生能夠從分子水平認(rèn)識(shí)腫瘤，對(duì)于腫瘤的理解更為深入。

［關(guān)鍵詞］

慢病毒介導(dǎo)的膠質(zhì)瘤模型;轉(zhuǎn)基因型腦膠質(zhì)瘤模型;移植腦膠質(zhì)瘤模型;教學(xué);學(xué)生

神經(jīng)膠質(zhì)瘤簡(jiǎn)稱膠質(zhì)瘤，是最常見的原發(fā)性中樞神經(jīng)系統(tǒng)腫瘤，約占所有顱內(nèi)原發(fā)腫瘤的一半。由于其臨床治療效果不佳，預(yù)后性差等因素的影響，神經(jīng)膠質(zhì)瘤成為中樞神經(jīng)腦腫瘤中發(fā)病率最高的原發(fā)性腫瘤。根據(jù)世界衛(wèi)生組織的分類系統(tǒng)，腦膠質(zhì)瘤根據(jù)其惡性程度可分為4個(gè)等級(jí)。其中Ⅲ和Ⅳ級(jí)膠質(zhì)瘤惡性程度很高，患者的平均存活時(shí)間僅為1年。因此，建立穩(wěn)定、可靠、易重復(fù)的膠質(zhì)瘤動(dòng)物模型，通過模型研究膠質(zhì)瘤的發(fā)病機(jī)制，找出合理的治療方案非常必要。目前，膠質(zhì)瘤動(dòng)物模型可分為誘發(fā)性腦膠質(zhì)瘤模型、移植腦膠質(zhì)瘤模型和轉(zhuǎn)基因型腦膠質(zhì)瘤模型3種。其中轉(zhuǎn)基因型腦膠質(zhì)瘤模型的建立是基于人們對(duì)癌基因激活以及抑癌基因失活等認(rèn)識(shí)不斷加深，以及轉(zhuǎn)基因和基因剔除技術(shù)的發(fā)展，是3種方法中最新的一種。該方法相比于另兩種方法，具有多種優(yōu)勢(shì):建立的系統(tǒng)更加穩(wěn)定;重復(fù)性好;分子機(jī)制清楚。我們通過比較慢病毒介導(dǎo)的轉(zhuǎn)基因型膠質(zhì)瘤模型［1］以及目前應(yīng)用最多的移植腦膠質(zhì)瘤模型在教學(xué)中的反饋評(píng)價(jià)，分析慢病毒介導(dǎo)的轉(zhuǎn)基因型膠質(zhì)瘤模型是否適合作為教學(xué)模型，以及它作為教學(xué)模型的意義。

一、對(duì)象和方法

隨機(jī)抽取臨床8年制5年級(jí)學(xué)生(n=50)作為實(shí)驗(yàn)操作者，根據(jù)不同的操作，將學(xué)生分為實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組。實(shí)驗(yàn)組為慢病毒介導(dǎo)的轉(zhuǎn)基因型膠質(zhì)瘤模型組，對(duì)照組為移植腦膠質(zhì)瘤模型組，每組25人，兩組學(xué)生隨機(jī)分組，年齡、相關(guān)基礎(chǔ)知識(shí)以及智力水平相當(dāng)。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物由上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物科學(xué)部提供，動(dòng)物合格證號(hào):［2012］038。2．操作方法實(shí)驗(yàn)操作前由教師講解實(shí)驗(yàn)所需的材料以及實(shí)驗(yàn)中的注意事項(xiàng)，著重向?qū)W生闡明選擇的模型的發(fā)展背景，使學(xué)生對(duì)實(shí)驗(yàn)材料有所認(rèn)識(shí)。實(shí)驗(yàn)組學(xué)生使用慢病毒載體使Ras表達(dá)或Akt激活，由于它們的表達(dá)受到Cre重組酶的控制，因此通過將病毒注入膠質(zhì)纖維酸性蛋白(glialfibrillaryacidicprotein，GFAP)-CreTp53+/－基因小鼠海馬區(qū)或腦室下區(qū)，可導(dǎo)致膠質(zhì)瘤的發(fā)生。其中GFAP-CreTp53+/－小鼠由GFAP-Cre轉(zhuǎn)基因小鼠與Tp53+/－小鼠進(jìn)行雜交產(chǎn)生腫瘤抑制子(tumorsuppressor，Tp53)，8～16周鼠齡時(shí)用于實(shí)驗(yàn)。使用氯胺酮麻醉小鼠，將少量的病毒(0.8μl，1×108IU)立體定位注射入小鼠。TomoH-RasV12lentiviralvectors和TomoAKTlentiviralvectors以1∶1混合注射。在注射后觀察小鼠的生存狀態(tài)，行為狀態(tài)以及體重的變化。觀察瘤的大小以及成瘤情況，并且進(jìn)行病理組織學(xué)檢查。對(duì)照組學(xué)生使用大鼠膠質(zhì)瘤細(xì)胞系9L腦紋狀體注射Wistar大鼠［2］，之后采取與實(shí)驗(yàn)組相似的方法觀察大鼠生存以及行為狀態(tài)，觀察成瘤情況以及病理組織學(xué)檢查等。完成所有實(shí)驗(yàn)后所有學(xué)生各自撰寫實(shí)驗(yàn)報(bào)告，報(bào)告內(nèi)容除了包括實(shí)驗(yàn)?zāi)康摹⒉僮鞑襟E等，需要著重撰寫:(1)實(shí)驗(yàn)中出現(xiàn)的困難;(2)實(shí)驗(yàn)后對(duì)于膠質(zhì)瘤發(fā)生的認(rèn)識(shí)。3．評(píng)價(jià)方法3.1統(tǒng)計(jì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果中成瘤大小、成瘤率。3.2課堂觀察的方法:以學(xué)生上課時(shí)的關(guān)注情況，對(duì)于課堂問題的參與應(yīng)答情況作為評(píng)價(jià)的因素。3.3課后撰寫實(shí)驗(yàn)報(bào)告的結(jié)果作為評(píng)價(jià)的因素3.4問卷調(diào)查:實(shí)驗(yàn)教學(xué)結(jié)束以后，通過教學(xué)效果問卷對(duì)兩組學(xué)生進(jìn)行調(diào)查，調(diào)查內(nèi)容包括對(duì)該模型的認(rèn)識(shí)以及對(duì)膠質(zhì)瘤的認(rèn)識(shí)程度等。4．統(tǒng)計(jì)學(xué)方法采用t檢驗(yàn)比較兩組之間的差異，P＜0.05為差異有顯著性。

二、結(jié)果

1．兩組模型成瘤情況比較兩組模型的成瘤率都是100%，說明建立這兩種模型都可以用來成瘤，但實(shí)驗(yàn)組形成的腫瘤大小更均一，而對(duì)照組腫瘤出現(xiàn)了較大或較小的現(xiàn)象。2．兩組學(xué)生課堂參與情況的比較兩組學(xué)生的上課關(guān)注情況被總結(jié)于表1中，通過比較可以看出兩組學(xué)生上課都很認(rèn)真，并且積極參與討論，與教師形成互動(dòng)。3．實(shí)驗(yàn)報(bào)告的撰寫結(jié)果從實(shí)驗(yàn)報(bào)告的得分上看(表2)，實(shí)驗(yàn)組學(xué)生的成績(jī)更高一些，主要原因是該組學(xué)生對(duì)于膠質(zhì)瘤的認(rèn)識(shí)更深入，對(duì)膠質(zhì)瘤的了解從宏觀到微觀都較對(duì)照組清晰。有多位對(duì)照組的學(xué)生都提到這種移植的方法的遺傳背景不清楚，這使得學(xué)生不能很好地理解膠質(zhì)瘤形成原因。而實(shí)驗(yàn)組在授課時(shí)教師就可以很清晰的闡明腫瘤的發(fā)生是由于癌基因的激活或者抑癌基因的失活所致，實(shí)驗(yàn)中設(shè)計(jì)的材料也涉及到癌癥中一些信號(hào)通路的激活等分子方面的知識(shí)，這些都使得學(xué)生能夠很好地理解實(shí)驗(yàn)安排的原因，將理論與實(shí)踐相結(jié)合。更有一些同學(xué)在報(bào)告中指出，其他已知的一些重要的癌基因也可以通過慢病毒介導(dǎo)在細(xì)胞中表達(dá)等，做到了舉一反三，說明慢病毒介導(dǎo)的膠質(zhì)瘤模型使用更為靈活。4．問卷調(diào)查結(jié)果與分析通過比較兩組學(xué)生的問卷，學(xué)生對(duì)實(shí)驗(yàn)本身的感興趣程度基本相似，但實(shí)驗(yàn)組學(xué)生對(duì)實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)的理解更為清楚，知道為什么會(huì)選擇相關(guān)基因的表達(dá)，為什么選擇GFAP-CreTp53+/－基因小鼠。對(duì)實(shí)驗(yàn)的因果由來了解都較清楚。相反，對(duì)照組的學(xué)生由于該模型自身的局限性，不能清楚知道其遺傳背景，對(duì)膠質(zhì)瘤的認(rèn)識(shí)不夠深入全面。學(xué)生問卷調(diào)查表明:慢病毒介導(dǎo)的膠質(zhì)瘤模型能更好地提高學(xué)生的學(xué)習(xí)興趣、自學(xué)能力、學(xué)習(xí)主動(dòng)性和獨(dú)立性，加強(qiáng)學(xué)生對(duì)理論知識(shí)的理解，提高學(xué)生臨床技能、臨床思維能力和綜合能力。慢病毒介導(dǎo)的膠質(zhì)瘤模型更為學(xué)生所接受和喜愛，慢病毒介導(dǎo)的膠質(zhì)瘤模型在激發(fā)學(xué)生學(xué)習(xí)興趣，提高學(xué)生主動(dòng)性，加深課堂知識(shí)理解和知識(shí)的長(zhǎng)期記憶上效果尤著，兩組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

三、討論

通過上述兩組的比較，我們發(fā)現(xiàn)實(shí)驗(yàn)組學(xué)生與對(duì)照組學(xué)生對(duì)實(shí)驗(yàn)本身的接受情況是類似的，但實(shí)驗(yàn)組學(xué)生通過該實(shí)驗(yàn)課對(duì)膠質(zhì)瘤的認(rèn)識(shí)更為深入，從分子水平上解釋了腫瘤的發(fā)生，這也是轉(zhuǎn)基因膠質(zhì)瘤模型優(yōu)于移植型膠質(zhì)瘤模型的地方。染色體畸變、堿基缺失或突變，或者腫瘤相關(guān)基因表觀修飾改變是腫瘤發(fā)生的主要原因［4］。許多膠質(zhì)瘤患者的腫瘤組織中存在PTK/Ras/PI3K、p53和Rb等基因的突變，其中p53、pTen、EGFR、CDKN2A/2B和NF-1是突變頻率最高的基因。膠質(zhì)瘤的形成是一個(gè)多因子、多種生物學(xué)行為的過程，包括某些通路異常激活、細(xì)胞周期被破壞等［5］。利用外源性方法模擬某種腫瘤形成過程就可以建立相應(yīng)的動(dòng)物模型［6］。實(shí)驗(yàn)組選取的小鼠是GFAP-CreTp53+/－基因重組小鼠，腫瘤抑制因子Tp53的突變有利于腫瘤的發(fā)生［7］。通過轉(zhuǎn)導(dǎo)慢病毒促進(jìn)Ras［8］以及Akt［9，10］的表達(dá)也進(jìn)一步促進(jìn)了腫瘤的發(fā)生。正是由于這些基因突變的發(fā)現(xiàn)，為建立轉(zhuǎn)基因膠質(zhì)瘤動(dòng)物模型提供了重要的基礎(chǔ)。同時(shí)慢病毒介導(dǎo)的膠質(zhì)瘤動(dòng)物模型，載體容易構(gòu)建，表達(dá)系統(tǒng)穩(wěn)定，免疫原性較小。最重要的是，在使用該方法時(shí)，可以根據(jù)實(shí)際情況調(diào)整相關(guān)基因，通過促進(jìn)其他單一或多個(gè)癌基因的表達(dá)，檢測(cè)成瘤率，因而非常靈活也更加實(shí)用。本研究表明，慢病毒介導(dǎo)的膠質(zhì)瘤動(dòng)物模型分子機(jī)制更為明確，能夠更清楚地從分子水平解釋腫瘤發(fā)生的原因，使學(xué)生對(duì)于膠質(zhì)瘤的發(fā)生有進(jìn)一步的認(rèn)識(shí)，因此適合作為教學(xué)模型推廣使用。

作者：宋大勇 李志強(qiáng) 權(quán)哲 趙軍 張寧 許大遠(yuǎn) 單位：上海交通大學(xué)附屬第六人民醫(yī)院南院