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《世界中西醫結合雜志》2015年第五期

1實驗方法

1．1銀翹散與給藥方法煎煮2次，合并濾液，過濾，濃縮至（生藥）2g／ml，流感病毒感染小鼠造模后1d開始給藥，陽性對照組給藥為磷酸奧司他韋溶液（10g／kg）；銀翹散組（10g／kg）。小鼠灌胃給藥0．1ml／10g，每天同時間點灌胃1次，正常組和模型組每天以等體積的蒸餾水灌胃，連續灌胃給藥6d。

1．2分組與造模／實驗方法

1．2．1流感病毒半數致死量（LD50）的測定30只BALB／c小鼠，隨機分成6組，每組5只，戊巴比妥鈉溶液小鼠腹腔注射麻醉，用4℃預冷PBS將增毒后的流感病毒新鮮尿囊液10倍梯度稀釋，共設6個濃度，分別為10－1～10－6，將稀釋好的6個濃度梯度流感病毒分別以20μl／只滴鼻造模，觀察14d，分別觀察小鼠發病狀態，記錄流感病毒各梯度稀釋組的死亡數，計算死亡率，按Reed＆Meunch法計算病毒的半數致死量（LD50）［2］。

1．2．2銀翹散存活實驗分組和流感病毒感染小鼠模型建立40只Balb／c小鼠，隨機分為4組，每組10只，分別為正常組、模型組、陽性對照組、銀翹散組，適應性喂養48h。取凍存的流感病毒，冰上解凍，用4℃PBS（pH＝7．4）將其稀釋為每20μl含4個LD50的病毒稀釋液。戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉，正常組以20μlPBS滴鼻造模，其余組以20μl病毒稀釋液滴鼻造模。

1．2．3銀翹散對流感病毒感染小鼠肺指數影響作用160只BALB／c小鼠，隨機分為16組，每組10只，分別為正常組1組，模型組5組，陽性對照5組、銀翹散5組，適應性喂養48h后進行實驗。造模后，分別于第1、3、5、7、9、11、13天每組隨機取3只小鼠，禁食不禁水4h，稱重，摘眼球方式取血，打開胸腔，無菌條件下取出全肺，生理鹽水洗滌2次，濾紙吸干肺組織多余水分，稱量肺重，計算肺指數。肺指數＝［肺重（g）／體重（g）］×100。

1．2．4肺總RNA提取和逆轉錄取50mg肺組織，置于EP管中，向EP管中加入10倍體積TRIzol，加入研磨球，放入研磨儀中60Hz，研磨30s；將勻漿液吸至無RNA酶EP管中，室溫靜置5min，加入100μl氯仿，上下顛倒震蕩15s，4℃，12000g離心10min，吸取上部水相，移至新EP管中，加入300μl異丙醇，混勻，室溫靜置10min，4℃，12000g離心10min，吸取液相，加入1ml75％乙醇洗滌沉淀，7500g離心5min，棄上清，室溫風干5min，加入無RNA酶水，金屬浴55℃溶解10min，檢測RNA完整性后，放－70℃保存備用。將模板RNA在冰上解凍，將5×gDNABuffer、FQ－RTPrimerMix、10×FastRTBuffer、RNase－freeddH20室溫下解凍，解凍后放冰上。其中去除基因組DNA體系為5×gDNABuffer2μl，模板RNA2μl，RNase－freeddH206μl，混勻，簡短離心后置于金屬浴42℃孵育3min，置于冰上，然后分別加入10×FastRTBuffer2μl，RT－EnzymeMix1μl，FQ－RTPrimerMix2μl，RNase－freeddH205μl至上步反應體系中，42℃孵育15min，95℃孵育3min后得cDNA，4℃保存。

1．2．5實時熒光定量PCR（RealTime－PCR）檢測病毒拷按照SuperRealPreMixPlus（SYBRGreen）熒光定量PCR試劑盒說明書進行實驗。根據引物設計原則，設計引物。上游引物為5′GACCAATCCTGTCACCTCTGAC3′；下游引物為5′AGGGCATTNTGGACAAAGCGTCTA3′；為消除不同RNA樣本之間的誤差，消除RNA使用量不同導致的誤差，設管家基因GAPDH作為對照。其中GAPDH的上游引物為5′TGGATTTGGACGCATTGGTC3′；下游引物為5′TTTGCACTGGTACGTGTTGAT3′，引物由軍事醫學科學院合成。加試劑和模板（只取第3天和第6天模板）加于PCR管中建立反應體系，將PCR管置于PCR儀中進行反應，反應體系為20μl，反應程序條件：50℃25min，92℃3min，92℃15s，55℃20s，68℃20s，37℃30s，共設置40個循環。每個樣品重復3次，將得到的Ct（thresholdofcycle）值進行統計學分析［3］，流感病毒拷貝＝2－（樣本Ct值－相應GAPDHCt值）。

1．3統計學處理采用SPSS13．0統計學軟件進行統計分析，所有實驗數據以均值±標準差（x±s）表示。采用SPSS17．0進行統計學分析，多組間差異采用單因素方差分析（one－wayANOVA），以P＜0．05為差異有統計學意義，P＜0．01為差異有極顯著性差異。

2結果

2．1小鼠半數致死量（LD50）測定小鼠感染病毒第3天，10－1～10－4稀釋病毒感染小鼠均出現體重降低、聳毛、顫抖、喘息、進食減少，聚堆，等癥狀；第5天開始感染小鼠開始行走搖擺不定，活動減少，除10－6組外，其余各組于第6天開始出現死亡情況。共觀察14d，統計各組小鼠死亡數目（見表1），經計算得出流感病毒的LD50為10－4．39。

2．2銀翹散對流感病毒感染小鼠的死亡保護作用流感病毒感染正常小鼠后，模型組的動物死亡率為100％，平均存活天數為5．31d，陽性對照組和銀翹散組較模型組的死亡率顯著降低，平均存活天數顯著增加（P＜0．01），可見陽性對照組和銀翹散組可有效保護流感病毒感染小鼠，提高生存率。結果見表2。

2．3銀翹散對流感病毒感染小鼠模型肺臟病毒滴度的影響實驗分別取小鼠感染第3天和第5天的逆轉錄的cDNA進行realtime－PCR實驗，結果顯示：正常組小鼠肺組織內無病毒載量表達；采用甲型流感病毒感染正常小鼠后，模型組各點小鼠肺組織病毒載量均顯著表達（P＜0．05），感染后給予用藥的陽性對照組及銀翹散組中，銀翹散組在感染后第3天和第5天病毒載量均顯著低于同時間點模型組（P＜0．05）。這表明銀翹散具有較好的抑制流感病毒作用。結果見表3。表3銀翹散對流感毒感染小鼠肺臟病毒載量的影響（x±s）組別劑量（g•kg－1）病毒拷貝（copies）3d5d正常組－00模型組－5．75×106±2．14×105a7．35×106±3．17×105a陽性對照組102．29×106±1．79×105ab3．51×105±1．29×104ab銀翹散組54．65×106±1．53×105b5．79×106±1．25×105b注：與正常組比較，aP＜0．05；與模型組比較，bP＜0．05

2．4銀翹散對流感病毒感染小鼠肺指數的影響結果顯示，流感病毒感染正常小鼠后，模型組小鼠的肺指數持續增加，在第7天達到最高值，在第9天時全部死亡，說明成功建立流感病毒小鼠模型。銀翹散組除第9天時肺指數略高于模型組外，其余各個時間點均低于模型組，差異有統計學意義（P＜0．01）。陽性對照組各個時間點的肺指數均低于模型組，差異有統計學意義（P＜0．01）。銀翹散組的肺指數要高于陽性對照組，提示陽性對照組對小鼠感染流感模型的保護作用要優于銀翹散組。總體上，銀翹散組在肺指數指標上對流感感染小鼠具有保護作用。結果見表4。

3討論

目前，流感仍是嚴重威脅人類健康的流行性疾病。中醫學認為流感屬“瘟病”范疇，由人體感受風邪病原侵襲，機體免疫力低下，不足以抗邪而得病，具有極強的傳染性，是能夠引起大范圍流行的外感熱病［4］。中藥治療疾病的基本原則為扶正祛邪，中藥抗流感的作用機制可能是通過阻斷流感病毒侵入宿主過程中的吸附、穿入、復制、成熟中的某一環節而直接抑制病毒，并通過提高機體的免疫功能，促進機體的特異性和非特異性免疫功能而間接抑制病毒［5］；中藥抗流感同時重視病毒—機體—藥物三者之間的辨證施治關系，不僅可以清除體內流感病毒，同時還能改善機體狀態，通過調動機體免疫功能來增強抗病毒感染的能力，相比于化學藥物，具有優越性。中藥在抗流感病毒方面通過抑制病毒復制、調節免疫功能、改善血液循環、解熱鎮痛、抗菌消炎等多途徑發揮作用，相關藥理研究［6］也發現銀翹散具有抗金黃色葡萄球菌等作用。通過動物實驗探討中藥抗流感病毒的效果，是從整體水平反映機體內抗病毒作用的有效途徑。中藥方劑的藥效作用是通過機體的整體作用來體現，因此動物實驗在抗流感病毒研究中具有十分重要的意義。本實驗按郭元吉［7］的小鼠感染流感病毒模型的方法，用甲型流感病毒FM1毒株滴鼻感染正常Balb／c小鼠，造成流感病毒性肺炎小鼠模型，以死亡率、肺指數和肺臟病毒拷貝為評價指標，評價銀翹散的抗流感病毒FM1株作用。本實驗結果表明，銀翹散可以提高感染小鼠的存活率，延長銀翹散用藥組存活時間和降低肺臟病毒載量，說明銀翹散在體內防治流感方面具有較好療效，能夠改善病毒感染所致機體的病變。充分體現了中醫治療的整體觀，也一定程度上揭示了中藥抗流感病毒在扶正與祛邪方面的科學性。

作者：張照研 張會敏 周喆 王升啟 單位：．河南中醫學院 山東省中醫藥研究院 軍事醫學科學院