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《世界中醫(yī)藥雜志》2015年第一期

1常用技術(shù)概要

1.1冰凍切片

1.1.技術(shù)特點(diǎn)冰凍切片是將新鮮組織快速冷凍后再進(jìn)行切片。制片周期較石蠟切片短，可用于組織結(jié)構(gòu)的快速觀察，也可用于一些不適于石蠟切片制備的組織的觀察，如脂肪組織。冰凍切片也可以進(jìn)行各種染色（圖2）。石蠟切片和冰凍切片均可用光學(xué)顯微鏡進(jìn)行觀察。

1.1.2應(yīng)用舉例團(tuán)隊(duì)對(duì)糖尿病并發(fā)癥有專門的研究。KKAy小鼠是一種自發(fā)糖尿病模型小鼠，利用小鼠觀察了中藥對(duì)糖尿病并發(fā)癥的治療作用。HE染色的石蠟切片顯示糖尿病小鼠肝臟結(jié)構(gòu)紊亂，肝細(xì)胞胞漿有明顯空泡，肝細(xì)胞有脂肪變性。進(jìn)而利用冰凍切片進(jìn)行油紅O染色，明確空泡內(nèi)確為脂肪。研究結(jié)果顯示能改善糖尿病小鼠肝臟結(jié)構(gòu)，對(duì)糖尿病造成的肝臟損害具有一定的保護(hù)作用［3］。

1.2電鏡超薄切片

1.2.1技術(shù)特點(diǎn)光學(xué)顯微鏡可觀察細(xì)胞的結(jié)構(gòu)，電子顯微鏡則能觀察亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)。常用的有透射電鏡和掃描電鏡技術(shù)，前者用于觀察細(xì)胞內(nèi)的超微結(jié)構(gòu)，如線粒體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)等；后者用于觀察樣本表面的變化，如支氣管的微絨毛（圖3）。超薄電鏡切片需要使用電子顯微鏡進(jìn)行觀察。

1.2.2應(yīng)用舉例我們團(tuán)隊(duì)研究了黃芪注射液和葛根素注射液對(duì)2型糖尿病小鼠腎臟病理改變的影響，在早期光鏡僅觀察到腎小球體積增大，腎小管上皮細(xì)胞有明顯空泡，未見其他改變。但通過電鏡觀察，發(fā)現(xiàn)腎小球基底膜有局灶性增厚，系膜基質(zhì)、系膜細(xì)胞增多，間質(zhì)細(xì)胞增生。說明在早期已經(jīng)出現(xiàn)了輕微的硬化性改變，且中藥可以減輕這些病理損害［4］。利用電鏡技術(shù)，我們還觀察了中藥對(duì)糖尿病模型小鼠腦微血管病變的影響，通過電鏡觀察，顯示模型組小鼠神經(jīng)細(xì)胞核染色質(zhì)疏松，線粒體腫脹，粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)縮小，核糖體減少，經(jīng)過中藥治療后上述改變減輕。說明中藥改善2型糖尿病動(dòng)物模型KKAy小鼠腦微血管病變［5］。

1.3組織化學(xué)技術(shù)

1.3.1技術(shù)特點(diǎn)組織化學(xué)是運(yùn)用物理學(xué)、化學(xué)、免疫學(xué)、分子生物學(xué)等原理與技術(shù)，對(duì)組織與細(xì)胞的化學(xué)成分、化學(xué)反應(yīng)及其變化規(guī)律進(jìn)行定性、定位和定量研究的科學(xué)，是介于這些學(xué)科之間的一門邊緣科學(xué)。其中在實(shí)際工作中較常用的是免疫組織化學(xué)技術(shù)。

1.3.2應(yīng)用舉例團(tuán)隊(duì)在復(fù)制大鼠慢性胃潰瘍模型的基礎(chǔ)上，通過免疫組化的方法檢測(cè)增殖細(xì)胞核抗原（PCNA），對(duì)半夏瀉心湯進(jìn)行拆方研究。結(jié)果表明，半夏瀉心湯及其拆方各組均有不同程度的調(diào)節(jié)胃黏膜細(xì)胞增殖作用。拆方各組中，部分藥組之間呈協(xié)同的作用趨勢(shì)，部分藥組之間呈制約趨勢(shì)。綜合評(píng)價(jià)其總體療效，以全方組最佳，從而印證了仲景組方的合理性和科學(xué)性［6］。

1.4細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)

1.4.1技術(shù)特點(diǎn)從組織中獲取細(xì)胞并使其在體外生長(zhǎng)稱為原代培養(yǎng)。也可購買細(xì)胞株直接進(jìn)行體外培養(yǎng)。培養(yǎng)的細(xì)胞是進(jìn)行各種醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)的良好材料。由于細(xì)胞種類單一，可用于觀察特定細(xì)胞對(duì)刺激因素的反應(yīng)，也可進(jìn)行較深入的機(jī)制研究。但由于是體外培養(yǎng)，細(xì)胞的反應(yīng)與體內(nèi)存在一定的差異。

1.4.2應(yīng)用舉例我們團(tuán)隊(duì)體外培養(yǎng)了人腎小管上皮細(xì)胞，并在此基礎(chǔ)上研究中藥對(duì)腎小管上皮細(xì)胞轉(zhuǎn)分化的影響。發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子（TGFβ1）可誘導(dǎo)體外培養(yǎng)的人腎小管上皮細(xì)胞發(fā)生轉(zhuǎn)分化，中藥可以阻斷或逆轉(zhuǎn)上皮細(xì)胞的轉(zhuǎn)分化［7］。我們還研究了中藥對(duì)人近曲小管上皮細(xì)胞細(xì)胞增殖的影響，以及對(duì)高糖誘導(dǎo)后細(xì)胞內(nèi)GRP78表達(dá)的影響。結(jié)果顯示，葛根素可促進(jìn)細(xì)胞增殖，并且可通過增加內(nèi)質(zhì)網(wǎng)伴侶蛋白GRP78的表達(dá)量，以促進(jìn)蛋白質(zhì)正確折疊，來恢復(fù)細(xì)胞的穩(wěn)態(tài)，從而減輕糖尿病時(shí)腎臟的結(jié)構(gòu)損傷［8］。

2應(yīng)用體會(huì)

以上這些基本的形態(tài)學(xué)技術(shù)可以與經(jīng)方的研究緊密結(jié)合起來，為經(jīng)方的實(shí)驗(yàn)研究提供可靠的技術(shù)保障。在以下幾方面，形態(tài)學(xué)技術(shù)都可以為經(jīng)方的研究提供技術(shù)保障。

2.1形態(tài)學(xué)技術(shù)可以客觀判定疾病模型的成功與否由于經(jīng)方是在臨床實(shí)踐中形成的經(jīng)典方劑，治療的對(duì)象是各種疾病。因此，復(fù)制多種疾病的動(dòng)物模型，并在此基礎(chǔ)上研究經(jīng)方的治療效果是經(jīng)方研究中的基礎(chǔ)工作。動(dòng)物的疾病模型復(fù)制是否具備與人類疾病相似的改變，直接決定了后續(xù)的研究是否能繼續(xù)，而很多動(dòng)物的疾病模型病變的判斷需要依賴形態(tài)學(xué)技術(shù)，在一些疾病中，形態(tài)學(xué)改變對(duì)于疾病的診斷起關(guān)鍵作用。如真武湯、五苓散、豬苓湯等均可用于治療糖尿病腎病，若在經(jīng)方的研究中結(jié)合形態(tài)學(xué)技術(shù)則能更客觀，研究結(jié)果也更容易被接受［9］。糖尿病腎病的主要形態(tài)學(xué)表現(xiàn)為早期腎小球肥大，晚期為腎間質(zhì)和腎小球纖維化。我們以往的研究發(fā)現(xiàn)，2型糖尿病腎病KKAy小鼠具有典型的糖尿病腎病的形態(tài)改變，黃芪可減輕該小鼠的腎臟病理損害，明確其對(duì)糖尿病腎病有治療作用。

2.2形態(tài)學(xué)技術(shù)可用于經(jīng)方治療疾病的機(jī)理研究在實(shí)驗(yàn)研究中，除了觀察經(jīng)方對(duì)多種疾病的治療效果，更重要的是揭示其作用機(jī)制和作用環(huán)節(jié)，進(jìn)而指導(dǎo)今后的中醫(yī)臨床。我們團(tuán)隊(duì)研究了TGFβ1信號(hào)通路在糖尿病腎病發(fā)病中的作用及其中藥的作用位點(diǎn)。由于在一個(gè)器官中有多種組織，僅通過分子生物學(xué)手段研究某些因子的表達(dá)情況，只能說明在器官中的平均表達(dá)水平，無法確定其在某一特定細(xì)胞或組織中的表達(dá)。如能將形態(tài)學(xué)技術(shù)與分子生物學(xué)技術(shù)結(jié)合起來，既能確定某一種因子的表達(dá)高低，又能將這種表達(dá)的改變定位，對(duì)于治療的作用機(jī)理的研究具有重要意義。我們?cè)鴮⒚庖呓M織化學(xué)技術(shù)與臨床生化指標(biāo)檢測(cè)、分子生物學(xué)技術(shù)結(jié)合起來，不但能說明中藥的治療效果，還能進(jìn)行機(jī)制研究［11］。除了進(jìn)行在體實(shí)驗(yàn)，還可以在體外培養(yǎng)細(xì)胞，利用細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)進(jìn)行較深入的機(jī)制研究。我們團(tuán)隊(duì)發(fā)現(xiàn)中藥對(duì)糖尿病腎病小鼠早期腎臟的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激反應(yīng)有一定的影響，為了確定中藥是否對(duì)腎小管上皮細(xì)胞的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激有同樣的作用，就利用體外培養(yǎng)的腎小管上皮細(xì)胞—HK2細(xì)胞，經(jīng)過高糖刺激后，觀察中藥對(duì)該細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的影響。發(fā)現(xiàn)高糖確實(shí)能誘導(dǎo)HK2細(xì)胞產(chǎn)生內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激，中藥對(duì)過度的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激有一定的抑制作用［8］。

2.3形態(tài)學(xué)技術(shù)可用于經(jīng)方的配伍研究通過拆方研究，確定最佳的配伍比例，可以為臨床醫(yī)生提供可靠的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。有實(shí)驗(yàn)通過復(fù)制臨床關(guān)節(jié)炎疾病的大鼠模型，比較了大鼠造模前后不同配伍比例的芍藥甘草湯的治療效果，發(fā)現(xiàn)芍藥甘草1∶1配伍時(shí)的止痛作用起效明顯早于其他配伍比例，證實(shí)了芍藥甘草湯原方配伍應(yīng)用的科學(xué)性和合理性。同時(shí)應(yīng)用了免疫組織化學(xué)的方法發(fā)現(xiàn)TRPV1（瞬時(shí)受體電位通道香草醛亞型1，transientreceptorpotentialvanilloidtype1）通道蛋白的表達(dá)可能是芍藥甘草湯臨床上發(fā)揮止痛作用的分子機(jī)制之一，同時(shí)也表明干預(yù)該靶點(diǎn)可能是芍藥甘草湯中芍藥和甘草1∶1配伍止痛效應(yīng)最大化的分子基礎(chǔ)［12］。為研究半夏瀉心湯的配伍規(guī)律，將該方拆成辛開藥（半夏、干姜，X）組，苦降藥（黃芩、黃連，K）組，甘補(bǔ)組（人參、炙甘草、大棗，G）組，并進(jìn)行交叉組合成XK、XG、KG組，及全方組（Q）。復(fù)制大鼠慢性胃潰瘍模型后，分別給予上述各組藥物治療，比較各組大鼠血清胃泌素的水平。結(jié)果表明X、K、G、KG組藥物對(duì)胃泌素?zé)o明顯影響；XK、XG組藥物對(duì)胃泌素有明顯影響，其中XG組的作用與Q組相近。上述結(jié)果提示：不同辛味藥物之間的配伍，直接影響其生物效應(yīng)［13］。這一實(shí)驗(yàn)結(jié)果為性味配伍理論提供了實(shí)驗(yàn)支持依據(jù)。

2.4形態(tài)學(xué)技術(shù)可用于經(jīng)方及中醫(yī)基本理論的研究我們團(tuán)隊(duì)在復(fù)制大鼠COPD模型的基礎(chǔ)上，觀察了宣肺中藥對(duì)其的影響，發(fā)現(xiàn)應(yīng)用宣肺中藥從肺論治COPD，肺組織病理改變減輕的同時(shí)伴見腸組織病理改變呈改善趨勢(shì)，從側(cè)面印證了中醫(yī)“肺合大腸”臟腑相關(guān)理論，肺－腸之間存在著一定的相關(guān)性及互動(dòng)調(diào)節(jié)現(xiàn)象。該項(xiàng)研究即使用了形態(tài)學(xué)技術(shù)，首先證實(shí)了模型大鼠具備了COPD的基本病理變化和宣肺中藥對(duì)此病理改變有減輕作用，進(jìn)而利用分子生物學(xué)技術(shù)證實(shí)宣肺中藥提高了腸組織IFNγ、降低了IL10mRNA的表達(dá)，一定程度上證實(shí)了肺－腸之間存在著一定的特異性互動(dòng)效應(yīng)機(jī)制，為探討“肺合大腸”中醫(yī)臟腑相關(guān)理論奠定基礎(chǔ)［14］。以上僅列舉了一些在經(jīng)方研究中用到的形態(tài)學(xué)技術(shù)，在今后的工作中，可以在更多領(lǐng)域使用形態(tài)學(xué)技術(shù)，形態(tài)學(xué)技術(shù)本身也隨著科技的發(fā)展不斷豐富。古老經(jīng)方的研究與不斷發(fā)展的形態(tài)學(xué)技術(shù)相結(jié)合，可以從不同角度和側(cè)面闡釋經(jīng)方的組方理念，總結(jié)其治療原則，讓更多的學(xué)者掌握經(jīng)方的科學(xué)內(nèi)涵，以更方便臨床醫(yī)生在實(shí)踐使用經(jīng)方。

作者：王謙李姝玉許紅高譽(yù)珊張淑靜李宇航單位：北京中醫(yī)藥大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院