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《生理學(xué)報》2016年第二期

摘要：

高糖、高脂食物的攝取會產(chǎn)生獎賞效應(yīng)。研究表明，高糖食物，如蔗糖或糖水的攝食經(jīng)歷，會影響動物對成癮性藥物的應(yīng)答，但是動物對高糖食物的攝取是否影響其對成癮性藥物的覓藥動機(jī)并不清楚。本研究通過自給食踏板訓(xùn)練使大鼠進(jìn)行蔗糖攝食，并觀察蔗糖自給食經(jīng)歷是否影響大鼠對可卡因的覓藥動機(jī)。在可卡因自給藥實驗中，與食物對照組相比，經(jīng)歷蔗糖自給食的大鼠表現(xiàn)出較高的踏板數(shù)和攝藥量、遞增比率的踏板破發(fā)點以及上移的劑量反應(yīng)踏板曲線，提示對可卡因覓藥動機(jī)的升高；在可卡因誘導(dǎo)的活動敏感性實驗中，經(jīng)歷蔗糖自給食的大鼠表現(xiàn)出較高的活動敏感性；在可卡因條件性位置偏愛實驗和曠場實驗中，經(jīng)歷蔗糖自給食的大鼠對可卡因配對側(cè)的偏愛和自主活動性與食物對照組相比無顯著差異；在高架十字迷宮以及條件性恐懼記憶實驗中，經(jīng)歷蔗糖自給食的大鼠的焦慮水平以及對聲音線索引起的僵直反應(yīng)與食物對照組相比沒有顯著變化。這些結(jié)果提示，蔗糖獎賞能夠增強(qiáng)大鼠對可卡因的覓藥動機(jī)。

關(guān)鍵詞：

蔗糖；可卡因；自給藥；覓藥動機(jī)

獎賞系統(tǒng)在人和動物的進(jìn)化過程中發(fā)揮著至關(guān)重要的作用。獎賞可以分為自然獎賞和藥物獎賞，前者指的是與生俱來的對某些物質(zhì)的渴望或者依賴，比如母愛、美食和性的獎賞[1]；而藥物獎賞，即指會使人和動物形成精神和軀體依賴的精神活性物質(zhì)產(chǎn)生的獎賞效應(yīng)[2]。接觸或長期服用此類精神活性物質(zhì)會導(dǎo)致藥物成癮，即一種難以根治、反復(fù)發(fā)作、以強(qiáng)迫性攝藥和不計后果地覓藥為特征的精神疾病[3]。以往的研究顯示，機(jī)體對高糖等自然獎賞物和成癮性藥物所產(chǎn)生的獎賞效應(yīng)在行為表現(xiàn)、神經(jīng)環(huán)路水平都存在一定的相似性：持續(xù)失控地攝入高糖食物或成癮性藥物會導(dǎo)致暴飲暴食癥[4]或藥物成癮[5,6]；正電子成像及核磁共振技術(shù)均提示中腦邊緣系統(tǒng)參與藥物成癮和高糖食物獎賞[7,8]；高糖食物和成癮藥物的強(qiáng)迫性攝取具有相似的細(xì)胞和分子生物學(xué)基礎(chǔ)[9–11]。此外，臨床研究證明人體對成癮性藥物與高糖食物的攝取行為之間相互影響[12]，同樣在動物實驗中高糖食物攝食經(jīng)歷會提高動物對成癮性藥物的攝藥量[13]。強(qiáng)烈的覓藥動機(jī)是藥物成癮的表現(xiàn)[3]，會促使機(jī)體持續(xù)大量用藥并導(dǎo)致藥物戒斷后的高復(fù)吸率。以往研究自然獎賞對藥物成癮行為的影響均從被動給予成癮性藥物引起的行為敏化、條件性位置偏愛或成癮性藥物自給藥的攝藥量方面進(jìn)行衡量，很少從覓藥動機(jī)方面研究蔗糖攝取對成癮性藥物覓藥行為的影響。自給藥模型通過讓大鼠自主踏板獲得成癮性藥物的靜脈注射，是模擬人自主給藥的一種模型，并能夠很好地量化藥物成癮行為[14]：固定比率(fixedratio,FR)給藥方案反映動物對成癮性藥物的攝藥量，遞進(jìn)比率給藥的破發(fā)點反映大鼠覓藥動機(jī)，劑量反應(yīng)可卡因自給藥操作曲線反映大鼠對藥物的敏感性[15]。本研究采用大鼠自給藥模型研究蔗糖攝取經(jīng)歷對可卡因覓藥動機(jī)的影響。對大鼠進(jìn)行蔗糖或普通食物自給食訓(xùn)練，之后對大鼠進(jìn)行可卡因自給藥實驗，通過采取不同的踏板操作策略檢測大鼠對可卡因的攝藥量及覓藥動機(jī)。

1材料與方法

1.1實驗材料

1.1.1實驗動物雄性Sprague-Dawley(SD)大鼠購自上海斯萊克實驗動物有限責(zé)任公司(SLAC-CAS)，每籠3~4只同齡同性大鼠，飼養(yǎng)于恒溫(23~25℃)、恒濕(45%~65%)的清潔級環(huán)境中。光照時間模擬顛倒的自然晝夜節(jié)律(7:00~19:00夜，19:00~次日7:00晝)，于黑暗周期進(jìn)行行為學(xué)測試。8周齡(300~350g)開始行為學(xué)測試。實驗開始前3天大鼠進(jìn)行限食(每天15~20g/只)，以維持體重是自由進(jìn)食情況下體重的85%。動物飼養(yǎng)及動物實驗方案遵循國家《實驗動物管理條例》和復(fù)旦大學(xué)倫理委員會動物實驗規(guī)范。

1.1.2主要試劑鹽酸可卡因粉劑(青海制藥廠)，45mg蔗糖丸(美國Bio-Serv公司)

1.1.3實驗設(shè)備大鼠條件操作箱(美國MedAssociates公司)，大鼠CPP檢測箱(美國MedAssociates公司)，大鼠自主活動性檢測箱(美國MedAssociates公司)，大鼠高架十字迷宮(美國MedAssociates公司)，大鼠條件性恐懼檢測箱(美國Coulbourn公司)。

1.2實驗方法

1.2.1自給食實驗實驗在大鼠條件操作箱中進(jìn)行，條件操作箱中設(shè)置有效和無效踏板，踏有效板時給予獎賞，蔗糖(sucrose)組獎賞為蔗糖丸，食物對照(chow)組獎賞為食物丸(45mg)，同時伴有聲光刺激，踏無效板時無任何獎賞和刺激。實驗采用FR踏板策略，F(xiàn)R1(即踏板1次給予獎賞)進(jìn)行5天，每天1h。同時設(shè)定程序，在蔗糖組和食物對照組踏板數(shù)(leverpress)到達(dá)100時即刻停止訓(xùn)練。第5天訓(xùn)練仍未能學(xué)會踏板獲得獎賞的(踏板數(shù)<100次)的個體予以剔除。

1.2.2頸靜脈插管手術(shù)及可卡因自給藥實驗學(xué)會踏板獲得獎賞的大鼠經(jīng)水合氯醛(0.4g/kg體重，上海生工)腹腔注射全身麻醉，將無菌硅膠管一側(cè)插入右側(cè)頸靜脈約3cm，另一側(cè)連于不銹鋼底座，用玻璃離子體水門汀固定于頭頂。術(shù)后休養(yǎng)6~7天，每天用溶有肝素鈉(30IU/mL)和硫酸慶大霉素(0.5mg/mL)的生理鹽水對靜脈插管進(jìn)行通管維護(hù)?？煽ㄒ蜃越o藥實驗在大鼠條件操作箱中進(jìn)行。大鼠踏有效板時給予可卡因靜脈注射(i.v.,0.75mg/kg)，同時伴有聲光刺激，踏無效板時無任何獎賞和刺激。實驗采用每天4h的FR和每天6h的PR策略。FR1進(jìn)行5天，F(xiàn)R3(即踏板3次給予獎賞)進(jìn)行2天，F(xiàn)R5(即踏板5次給予獎賞)進(jìn)行5天；PR策略中，踏板數(shù)為[5e0.2i−5]時給予獎賞(i為獎賞次數(shù))，獲得最后一次獎賞所需的踏板數(shù)為破發(fā)點(breakpoint)。采用每天4h的FR5策略對大鼠進(jìn)行劑量反應(yīng)可卡因自給藥實驗，進(jìn)行6天，每天每次給藥劑量分別為0、0.03、0.1、0.3、0.5、1mg/kg。

1.2.3曠場實驗及可卡因誘導(dǎo)的活動敏感性實驗實驗均在自主動性檢測箱(長40cm，寬40cm，高35cm)中進(jìn)行。進(jìn)行曠場實驗時，使大鼠在實驗環(huán)境中適應(yīng)30min后，將大鼠放入檢測箱中，使其自主活動30min，記錄大鼠的活動距離。檢測大鼠對可卡因的活動敏感性時，使大鼠適應(yīng)實驗環(huán)境30min后，將大鼠置于自主活動性檢測箱中適應(yīng)1h，之后每小時依次腹腔注射(i.p.)0、2.5、7.5、15mg/kg遞增劑量的可卡因，記錄不同劑量可卡因注射后大鼠的活動情況。

1.2.4高架十字迷宮實驗將大鼠置于實驗環(huán)境中適應(yīng)30min后，面對開臂放入高架十字迷宮的中間區(qū)域，使大鼠自由穿梭5min，記錄大鼠在中間區(qū)(center)，開臂(arm)和閉臂(darm)中所處的時間。

1.2.5條件性恐懼實驗實驗在大鼠條件性恐懼箱中進(jìn)行。大鼠在實驗環(huán)境中適應(yīng)30min后，置于條件性恐懼箱中適應(yīng)2min，之后連續(xù)5次給予單音線索刺激聯(lián)合的足底電擊，96dB單音20s，在單音的最后1s給予0.5mA電擊，每次單音之間間隔90s。24h后對聲音線索(cue)誘導(dǎo)的恐懼反應(yīng)進(jìn)行檢測。改變恐懼箱環(huán)境，將大鼠放入箱中，適應(yīng)90s，給予1次30s單音刺激，記錄大鼠在適應(yīng)期和聲音線索期的僵直(freezing)情況。

1.2.6CPP實驗實驗在CPP檢測箱中進(jìn)行。CPP檢測箱是兩箱系統(tǒng)，兩箱地板和四壁環(huán)境線索不同。第一天，大鼠在箱中自由穿梭適應(yīng)30min，將在其中一側(cè)所處時間是另一側(cè)時間的兩倍以上的大鼠予以剔除，隨后分配生理鹽水配對側(cè)和可卡因配對側(cè)，使兩組大鼠在兩側(cè)箱所處的時間均值和標(biāo)準(zhǔn)差一致。第2~4天，兩側(cè)隔離，將大鼠注射生理鹽水(i.p.)并置于生理鹽水配對側(cè)30min，放回原籠內(nèi)。4h后給予大鼠可卡因注射(15mg/kg,i.p.)并將其置于可卡因配對側(cè)30min。第5天，進(jìn)行大鼠CPP檢測，撤去兩側(cè)隔離，將大鼠放于箱中自由穿梭30min，記錄大鼠在兩側(cè)所處時間。大鼠對可卡因配對側(cè)的偏愛性由CPP評分(CPPscore)衡量，CPP評分=可卡因配對側(cè)時間−生理鹽水配對側(cè)時間。

1.2.7統(tǒng)計分析方法數(shù)據(jù)以mean±SEM表示，用SigmaPlot12.3軟件對實驗數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計、分析、作圖。統(tǒng)計學(xué)顯著性檢驗采用獨立樣本t檢驗(Student’sttest)和重復(fù)測量的雙因素方差分析(two-wayRMANOVA)，食物對照組和蔗糖組在每個不同時間或劑量上的行為學(xué)差異采用Bonferronipost-hoc檢驗。P<0.05時認(rèn)為具有統(tǒng)計學(xué)差異。

2結(jié)果

2.1蔗糖自給食經(jīng)歷增加大鼠對可卡因的覓藥動機(jī)在自給食訓(xùn)練前，我們將大鼠放入自主活動性檢測箱中，檢測大鼠的自主活動性。隨后對無自主運動障礙的大鼠進(jìn)行隨機(jī)分組，分別進(jìn)行蔗糖和食物的自給食訓(xùn)練。自給食訓(xùn)練后的大鼠進(jìn)行頸靜脈插管手術(shù)，恢復(fù)6~7天后進(jìn)行可卡因自給藥實驗，大鼠踏板給予可卡因注射(每次0.75mg/kg,i.v.)?？煽ㄒ蜃越o藥實驗首先采用FR踏板策略，5天FR1，之后進(jìn)行2天FR3和5天FR5。結(jié)果顯示，蔗糖組大鼠FR踏板數(shù)明顯高于食物對照組，蔗糖組大鼠對可卡因的攝藥次數(shù)也顯著高于食物對照組，這一結(jié)果與前人的研究結(jié)果一致[16]。由實驗結(jié)果可知，在可卡因自給藥前期，兩組大鼠的踏板數(shù)和攝藥量并無差別：在踏板數(shù)方面，兩組大鼠在前7天沒有顯著差別，踏板數(shù)的差別從第8天開始出現(xiàn)；在給藥次數(shù)方面，兩組大鼠在前4天沒有顯著差別，給藥次數(shù)的差別從第5天開始。因此，蔗糖組大鼠在可卡因自給藥中表現(xiàn)的高踏板數(shù)和攝藥量并非是壓桿獲取獎賞這一行為的強(qiáng)化引起。在PR階段，蔗糖組大鼠的破發(fā)點水平明顯高于食物對照組，說明蔗糖組大鼠對可卡因的覓藥動機(jī)更強(qiáng)。使用FR5策略對大鼠進(jìn)行可卡因劑量反應(yīng)自給藥檢測，每天每次注射可卡因劑量分別為0、0.03、0.1、0.3、0.5、1mg/kg。結(jié)果顯示，蔗糖組大鼠有效踏板數(shù)及攝藥次數(shù)的劑量反應(yīng)曲線較食物對照組均發(fā)生顯著上，其中在可卡因低劑量0.03和0.1mg/kg時踏板數(shù)和攝藥次數(shù)均顯著高于食物對照組。劑量反應(yīng)曲線的上移是對成癮性藥物動機(jī)增強(qiáng)的表現(xiàn)[17]，說明蔗糖組大鼠對可卡因的覓藥動機(jī)高于食物對照組。以上兩種可卡因自給藥策略均證明蔗糖攝取經(jīng)歷增強(qiáng)大鼠對可卡因的覓藥動機(jī)。

2.2蔗糖自給食經(jīng)歷對大鼠的可卡因CPP和自主活動性的影響上述實驗提示，蔗糖獎賞會提高大鼠對可卡因自給藥的覓藥動機(jī)，那么蔗糖攝取是否會影響大鼠對可卡因的CPP呢？結(jié)束自給食訓(xùn)練的大鼠休息5~6天后，進(jìn)行可卡因CPP實驗(圖2A)。第1天，將大鼠放入CPP箱使其自由探索30min(Pre-test)；第2~4天，給予大鼠生理鹽水和可卡因(15mg/kg,i.p.)注射后將大鼠分別放入對應(yīng)箱中30min，生理鹽水與可卡因注射時間相隔4h(Conditioning)；第5天，再次使大鼠自由探索CPP箱，檢測大鼠對CPP兩側(cè)箱的偏愛程度(Test)。結(jié)果顯示，蔗糖組大鼠的CPP評分與食物對照組相比無顯著差異(圖2B)，說明蔗糖自給食經(jīng)歷對大鼠可卡因誘導(dǎo)的CPP影響不顯著。為排除大鼠自主活動能力對可卡因CPP及自給藥實驗的影響，我們比較了大鼠自給食訓(xùn)練前(Pre-SA)和自給食訓(xùn)練后(Post-SA)5~6天的曠場實驗結(jié)果。結(jié)果顯示，自給食訓(xùn)練前后，蔗糖組或食物對照組大鼠在30min內(nèi)的活動距離沒有差異(圖2C)，說明自給食訓(xùn)練不影響大鼠自主活動能力。

2.3蔗糖自給食經(jīng)歷對大鼠的可卡因活動敏感性的影響我們對蔗糖自給食后的大鼠進(jìn)行可卡因誘導(dǎo)的活動敏感性實驗，使大鼠在曠場中接受遞增劑量的可卡因注射(i.p.,0,2.5,7.5,15mg/kg)，以檢測大鼠在不同可卡因劑量下活動敏感性的變化(圖3A)。實驗結(jié)果顯示，蔗糖組大鼠對遞增劑量可卡因產(chǎn)生的活動敏感性較食物對照組大鼠高，這一結(jié)果與前人的研究結(jié)果相一致[18]，其中在可卡因劑量為15mg/kg時，蔗糖組大鼠的活動敏感性顯著高于食物對照組。

2.4蔗糖自給食經(jīng)歷對大鼠的焦慮水平及條件性恐懼記憶的影響我們對蔗糖自給食后的大鼠進(jìn)行高架十字迷宮實驗。蔗糖組大鼠在中間區(qū)、開臂及閉臂中所處時間與食物對照組大鼠相比均沒有差異(圖4A)，說明蔗糖自給食經(jīng)歷不會顯著影響大鼠的焦慮水平。我們也對大鼠進(jìn)行聲音誘導(dǎo)的條件性恐懼記憶訓(xùn)練，以檢驗蔗糖獎賞是否影響大鼠的條件性恐懼記憶。將大鼠放入條件恐懼箱中，適應(yīng)環(huán)境后給予足底電擊并伴隨聲音線索(fearconditioning)，第二天，改變檢測箱環(huán)境進(jìn)行聲音誘導(dǎo)的恐懼記憶檢測(Test,圖4B)。結(jié)果顯示，蔗糖組大鼠在聲音線索(Cue)誘導(dǎo)下的僵直水平與食物對照組相比無明顯差異(圖4C)，說明蔗糖自給食經(jīng)歷不會顯著影響大鼠的條件性恐懼記憶。

3討論

自然獎賞會對藥物成癮產(chǎn)生影響。以往研究自然獎賞影響藥物成癮行為時，多采用自給藥踏板表示的獲藥量、CPP、活動敏感性和行為敏化方面進(jìn)行探究。在自主攝藥方面，豐富環(huán)境會降低安非他明自給藥水平[19]，而高脂食物攝取會增強(qiáng)可卡因自給藥水平[20]，蔗糖攝取會增強(qiáng)可卡因和海洛因的自給藥水平[16]；在CPP方面，高脂食物攝取會降低安非他明引起的CPP[21]，EE會抑制嗎啡、可卡因引起的CPP[22,23]，而自主跑輪活動會增強(qiáng)嗎啡引起的CPP[24]，蔗糖攝取則會增強(qiáng)大鼠嗎啡及安非他明CPP的形成[25,26]，卻不影響可卡因CPP的形成[27]；在劑量反應(yīng)操作曲線方面，跑輪活動后的大鼠在海洛因劑量反應(yīng)自給藥中的操作曲線較對照組上移[28]；在活動敏感性(藥物急性注射誘導(dǎo))和行為敏化(藥物反復(fù)注射誘導(dǎo))方面，高脂食物攝取不影響大鼠的由可卡因及安非他明誘導(dǎo)的活動敏感性和行為敏化[29]，EE會降低由嗎啡誘導(dǎo)的活動敏感性和行為敏化[22,30]，而間斷性糖水喂食會增強(qiáng)由安非他明誘導(dǎo)的活動敏感性[13,31]及由可卡因誘導(dǎo)的活動敏感性和行為敏化[18,32]。上述研究提示蔗糖攝食會增強(qiáng)可卡因引起的活動敏感性和行為敏化，提高動物在可卡因自給藥中的攝藥量，但很少從覓藥動機(jī)方面探究蔗糖獎賞對藥物成癮的影響，難以體現(xiàn)動物覓藥動機(jī)的改變。本研究通過可卡因自給藥實驗的FR踏板策略(FR1，F(xiàn)R3和FR5)，檢測出蔗糖組大鼠較食物對照組對可卡因較高的踏板數(shù)和攝取量，這一結(jié)果與前人的研究結(jié)果一致[16]；與此同時，通過PR踏板的破發(fā)點水平和劑量反應(yīng)可卡因自給藥的踏板曲線衡量大鼠對可卡因的覓藥動機(jī)，發(fā)現(xiàn)蔗糖組大鼠在PR中的破發(fā)點較食物對照組高，在劑量反應(yīng)自給藥中的操作曲線較食物對照組上移。高的破發(fā)點和上移的操作曲線意味著覓藥動機(jī)的增強(qiáng)[15,17]，本研究結(jié)果提示蔗糖獎賞提高大鼠對可卡因的覓藥動機(jī)，這是以往未見報道的。

本研究進(jìn)一步對大鼠進(jìn)行可卡因CPP實驗，用15mg/kg的可卡因劑量進(jìn)行誘導(dǎo)，實驗結(jié)果為蔗糖組大鼠對可卡因配對側(cè)的偏愛與食物對照組大鼠表現(xiàn)無顯著差別。有研究報道大鼠攝食蔗糖水后進(jìn)行可卡因CPP檢測(15mg/kg)，表現(xiàn)的CPP評分與普通水組大鼠無差別[27]，與本實驗結(jié)果相似；我們也進(jìn)行了可卡因活動敏感性實驗，結(jié)果為蔗糖組大鼠的活動敏感性較食物對照組高，這一結(jié)果與前人的研究[18]相一致。在15mg/kg可卡因劑量下，蔗糖組大鼠的活動敏感性顯著高于食物對照組，提示兩組大鼠在15mg/kg可卡因誘導(dǎo)的CPP評分無差別并非因為可卡因劑量達(dá)到“天花板效應(yīng)”。CPP模型的原理是將可卡因獎賞的非條件性刺激與環(huán)境線索的條件性刺激進(jìn)行關(guān)聯(lián)記憶，故而也有研究認(rèn)為CPP模型也是一種衡量關(guān)聯(lián)學(xué)習(xí)記憶能力的行為模型，并不能很好地衡量動物的覓藥動機(jī)[33]。因此蔗糖組大鼠的CPP評分與食物對照組大鼠一致這一結(jié)果提示兩組大鼠有同樣的獎賞相關(guān)的學(xué)習(xí)記憶能力，與蔗糖組大鼠在可卡因自給藥中顯示出的覓藥動機(jī)增加并不矛盾。此外條件恐懼性記憶實驗的結(jié)果也表明，蔗糖經(jīng)歷不影響大鼠的關(guān)聯(lián)性學(xué)習(xí)記憶能力。

本研究通過踏板使大鼠進(jìn)行蔗糖和普通食物的自主攝食，進(jìn)行FR1踏板訓(xùn)練。為了避免蔗糖等獎賞刺激對壓桿行為的強(qiáng)化，我們設(shè)定程序，在蔗糖組和食物對照組踏板數(shù)到達(dá)100時即刻停止訓(xùn)練，使兩組大鼠在可卡因自給藥實驗前的踏板水平基本保持一致。經(jīng)過食物和蔗糖自給食訓(xùn)練的大鼠經(jīng)頸靜脈插管手術(shù)后進(jìn)行可卡因自給藥實驗，實驗結(jié)果顯示(圖1A，B)，在可卡因自給藥的前期兩組大鼠的踏板數(shù)和攝藥量并無差別。因此，蔗糖組大鼠在可卡因自給藥中表現(xiàn)的高踏板數(shù)和攝藥量可以歸結(jié)為對可卡因的覓藥動機(jī)增強(qiáng)，而并非是壓桿獲取獎賞這一行為的強(qiáng)化引起的。本研究通過可卡因自給藥實驗的PR踏板和劑量反應(yīng)策略，檢測出蔗糖組大鼠較食物對照組大鼠對可卡因有更強(qiáng)的覓藥動機(jī)，提示蔗糖獎賞增強(qiáng)大鼠對可卡因的動機(jī)。本研究從覓藥動機(jī)方面研究了蔗糖自給食經(jīng)歷對可卡因成癮行為的影響，為研究自然獎賞影響藥物成癮提供了新的線索和依據(jù)。

作者：李彥慶 樂秋旻 于向沉 馬蘭 王菲菲 單位：復(fù)旦大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院醫(yī)學(xué)神經(jīng)生物學(xué)國家重點實驗室