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《藥物評(píng)價(jià)研究雜志》2015年第三期

1方法

1.1Ponatinib細(xì)胞毒活性測(cè)定采用CCK-8法[4]檢測(cè)Ponatinib對(duì)正常HUVECs的細(xì)胞毒作用。用含10%FBS的DMEM高糖培養(yǎng)基于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)HUVECs細(xì)胞，收集5～8代處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞消化、重懸、計(jì)數(shù)，以5×104/mL密度每孔100μL接種細(xì)胞至96孔板。待細(xì)胞貼壁后，去除培養(yǎng)液，對(duì)照孔加入不含藥物的新鮮培養(yǎng)液100μL，給藥組每孔加入不同濃度的含藥培養(yǎng)液100μL，設(shè)3個(gè)復(fù)孔，于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)48h，每孔加入CCK-8試劑10μL，于CO2培養(yǎng)箱中孵育1h后，用酶標(biāo)儀于450nm波長(zhǎng)下測(cè)定吸光度（A）值。使用GraphPadprism5.0軟件擬合非線性曲線，并計(jì)算Ponatinib對(duì)HUVECs細(xì)胞的半數(shù)抑制濃度（IC50）。抑制率＝（A陰性－A樣品）/A陰性

1.2Ponatinib對(duì)細(xì)胞遷移能力影響采用體外劃痕試驗(yàn)[5]觀察Ponatinib對(duì)HUVECs細(xì)胞遷移能力的影響。將5×104/mL的HUVECs細(xì)胞接種至24孔板，每孔500μL，24h后，用滅菌的10μL槍頭在單層細(xì)胞上呈“一”字劃痕，吸掉培養(yǎng)液，用PBS清洗3遍，去除劃掉的細(xì)胞，每孔加入藥物濃度依次為0.01、0.05、0.10μmol/L的含藥培養(yǎng)液500μL，每個(gè)濃度設(shè)置3個(gè)復(fù)孔，以不含藥物的孔作為陰性對(duì)照，于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)，直至陰性對(duì)照組劃痕兩側(cè)的細(xì)胞布滿劃痕后拍照觀察，并對(duì)各組遷移至劃痕中央的細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù)，計(jì)算遷移率。遷移率＝藥物組劃痕區(qū)域細(xì)胞數(shù)/對(duì)照組劃痕區(qū)域細(xì)胞數(shù)

1.3Ponatinib對(duì)細(xì)胞成管能力影響采用體外血管形成試驗(yàn)[6]考察Ponatinib對(duì)HUVECs細(xì)胞成管能力的影響。將100μL槍頭、96孔板、Matrigel基質(zhì)膠置于4℃冰箱過(guò)夜預(yù)冷。于96孔板加入Matrigel基質(zhì)膠50μL/孔，37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中溫孵0.5～1h。取融合80%～90%HUVECs細(xì)胞以3.0×104/孔的密度接種到96孔板，分別加入10μL的含藥培養(yǎng)液使Ponatinib終濃度依次為0.01、0.05、0.10μmol/L，每組設(shè)3個(gè)復(fù)孔。溫孵10h后于倒置顯微鏡低倍鏡下觀察拍照，記錄各組細(xì)胞成管情況，根據(jù)管型情況進(jìn)行評(píng)分：細(xì)胞形成閉合的多邊形評(píng)4分，細(xì)胞排列呈多邊形但未閉合評(píng)3分，細(xì)胞排列呈線性結(jié)構(gòu)評(píng)2分，細(xì)胞未成管散在或聚集成簇評(píng)1分[7]。

1.4Ponatinib對(duì)細(xì)胞NO釋放的影響將HUVECs細(xì)胞以1×106/孔的密度接種至6孔板，24h后，每孔加入濃度依次為0.01、0.05、0.10μmol/L的含藥培養(yǎng)液2mL，每個(gè)濃度設(shè)置3個(gè)復(fù)孔，以不含藥物的孔作為陰性對(duì)照，于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)24～48h，取細(xì)胞上清液100μL，按照NO硝酸還原法試劑盒說(shuō)明書的方法進(jìn)行檢測(cè)。

1.5統(tǒng)計(jì)學(xué)分析采用GraphPadprism5.0軟件進(jìn)行One-wayANOVA分析[8]。數(shù)據(jù)采用x±s表示。

2結(jié)果

2.1HUVECs細(xì)胞毒作用結(jié)果表明Ponatinib對(duì)HUVECs細(xì)胞株增殖顯示出較強(qiáng)的抑制作用。隨著藥物濃度的升高，抑制率也升高，在0.1～10μmol/L呈現(xiàn)出典型的濃度相關(guān)性（圖1）。使用GraphPadprism5.0軟件計(jì)算得到Ponatinib對(duì)HUVECs細(xì)胞的IC50為（0.69±0.05）μmol/L。另外，0.01、0.05、0.10μmol/L濃度的Ponatinib對(duì)HUVECs細(xì)胞的抑制率小于10%，對(duì)細(xì)胞的增殖影響較小，可作為Ponatinib的非毒性劑量用于考察該藥物對(duì)細(xì)胞遷移、成管及NO水平的影響。

2.2細(xì)胞遷移能力影響相同作用時(shí)間下，給藥組的細(xì)胞向劃痕中央遷移的數(shù)量明顯少于對(duì)照組，說(shuō)明經(jīng)藥物處理后的HUVECs細(xì)胞的劃痕愈合能力與對(duì)照組相比較差，且隨著Ponatinib濃度的增加，差異越顯著（P＜0.05）（圖2和表1），即Ponatinib對(duì)血管內(nèi)皮細(xì)胞遷移能力的影響呈劑量相關(guān)性，藥物濃度為0.01μmol/L時(shí)已經(jīng)達(dá)到半數(shù)抑制率。

2.3細(xì)胞成管能力的影響由HUVECs細(xì)胞成管圖像可得，不同濃度Ponatinib作用下，HUVECs細(xì)胞在Matrigel基質(zhì)膠上血管形成情況存在顯著差異（圖3）。成管評(píng)分結(jié)果顯示，0.05、0.10μmol/L的Ponatinib組評(píng)分均顯著低于對(duì)照組（P＜0.05）（圖4），說(shuō)明非毒性劑量的Ponatinib能劑量相關(guān)地抑制HUVECs細(xì)胞的血管形成能力。

2.4細(xì)胞NO釋放水平影響不同濃度Ponatinib處理HUVECs細(xì)胞24h和48h后，采用硝酸還原法間接檢測(cè)細(xì)胞上清液的NO濃度，結(jié)果顯示，相同作用時(shí)間下，給藥組的細(xì)胞培養(yǎng)液中的NO濃度明顯低于對(duì)照組（P＜0.05）（表2），表明Ponatinib抑制HUVECs細(xì)胞NO的合成與釋放，且作用時(shí)間越長(zhǎng)，NO濃度降低越顯著。

3討論

Ponatinib為典型的靶向抗癌藥物，為小分子多激酶抑制劑，主要作用于BCR-ABL、血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子受體（VEGFR）等多種激酶。FDA相關(guān)資料報(bào)道，Ponatinib誘發(fā)血栓及其他血管毒性與Ponatinib對(duì)VEGFR的抑制作用有關(guān)，并預(yù)測(cè)可能與索拉菲尼（Sorafenib）、帕唑替尼（Pazopanib）、舒尼替尼（Sunitinib）及貝伐單抗（Bevacizumab）等VEGF信號(hào)通路（VSP）抑制劑血管不良反應(yīng)機(jī)制密切相關(guān)[9]。近年來(lái)，VSP抑制劑如索拉菲尼等引發(fā)的血管毒性不良反應(yīng)頻繁報(bào)道[10]。VSP抑制劑通過(guò)阻斷VEGF-VEGFR相互作用，阻斷其下游信號(hào)PI3K/AKT/eNOS等通路的傳遞，進(jìn)而影響血管內(nèi)皮細(xì)胞的增殖、遷移及血管形成等正常生理功能，導(dǎo)致血管內(nèi)皮損傷[11]；另外，當(dāng)血管內(nèi)皮細(xì)胞功能受損時(shí)，其凝血與抗凝血、纖溶與抗纖溶的平衡會(huì)失調(diào)[12]。而凝血系統(tǒng)激活、纖溶系統(tǒng)失活及血小板黏附聚集是血栓形成的重要環(huán)節(jié)。NO是由血管內(nèi)皮細(xì)胞產(chǎn)生的一種氣體信號(hào)分子，通過(guò)促進(jìn)血管舒張、抑制血小板聚集和白細(xì)胞黏附調(diào)節(jié)血管的功能[13]。正常生理狀態(tài)下，機(jī)體主要通過(guò)AKT/eNOS通路調(diào)節(jié)p-eNOS的表達(dá)，進(jìn)而調(diào)控血管內(nèi)皮細(xì)胞對(duì)NO的合成釋放來(lái)實(shí)現(xiàn)對(duì)血管收縮和舒張功能的調(diào)節(jié)[14]。NO活性降低會(huì)誘發(fā)多種病理變化，包括改變內(nèi)皮的抗凝功能，干擾內(nèi)皮的生長(zhǎng)和再生功能[15]。

本文以此為研究依據(jù)，從Ponatinib對(duì)正常血管內(nèi)皮細(xì)胞的功能影響方面初步考察Ponatinib致血栓的相關(guān)機(jī)制。研究發(fā)現(xiàn)，Ponatinib對(duì)HUVECs細(xì)胞的IC50為（0.69±0.05）μmol/L，而45mg單次口服劑量的Ponatinib在惡性血液病患者體內(nèi)的血藥濃度峰值（Cmax）為（0.161±0.098）μmol/L[16]，即Cmax范圍為0.063～0.25μmol/L，結(jié)合細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)分析，在此濃度范圍內(nèi)的Ponatinib對(duì)人血管內(nèi)皮細(xì)胞有不同程度的毒性作用；另外，本研究還發(fā)現(xiàn)低于人體內(nèi)Cmax的Ponatinib（0.01～0.1μmol/L）能夠顯著抑制HUVECs細(xì)胞的遷移、血管形成及NO的釋放（P＜0.05）。提示Ponatinib可能通過(guò)抑制內(nèi)皮細(xì)胞增殖、遷移、血管形成，影響NO合成導(dǎo)致內(nèi)皮細(xì)胞功能障礙，從而改變血管內(nèi)皮的抗凝、生長(zhǎng)及再生功能，最終誘發(fā)動(dòng)靜脈血管狹窄、血栓等病理變化。對(duì)PI3K/AKT/eNOS等信號(hào)通路相關(guān)機(jī)制有待進(jìn)一步研究。目前，Ponatinib在臨床治療中具有不可替代性，因心血管毒性影響其使用，期待該藥全面評(píng)估安全性并通過(guò)改造恢復(fù)其臨床廣泛應(yīng)用。

作者：張亞楠 孫繼紅 黃新益 項(xiàng)儀賓 余伯陽(yáng) 單位：中國(guó)藥科大學(xué) 南京圣和藥業(yè)股份有限公司