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《中國預防獸醫學報》2014年第八期

1材料和方法

1.1重組桿狀病毒制備將pFastBac-G-VP73轉化含有穿梭載體Bacmid的DH10Bac大腸桿菌感受態細胞，通過藍白斑篩選及劃線培養、純化陽性菌落，經PCR鑒定后獲得重組桿粒Bacmid-G-VP73。利用脂質體介導轉染法，將Bacmid-G-VP73轉染到Sf9昆蟲細胞中，于28℃培養，待出現細胞病變后，收集細胞培養上清液即含有重組桿狀病毒。

1.2重組桿狀病毒感染BHK-21細胞將重組桿狀病毒液加入細胞培養板中生長至60%的BHK-21細胞單層中，28℃感染4h，更換培養基，37℃培養48h。1.6Westernblot檢測目的蛋白的表達收集重組桿狀病毒感染48h后的BHK-21細胞，裂解后12000r/min離心5min，收集上清液，以VP73MAb為一抗，羊抗鼠IgG-HRP為二抗進行westernblot鑒定。

2結果與討論

2.1重組真核表達質粒pcDNA-VP73的構建以含有VP73全基因的重組質粒為模板，采用引物P1/P2進行PCR擴增，檢測結果表明，PCR產物片段約為1200bp。純化的擴增產物經雙酶切回收后，克隆于pcDNA3.1中構建重組質粒pcDNA-VP73。經測序結果表明VP73基因為1188bp，與預期結果一致。

2.2重組穿梭載體(Bacmid-G-VP73)的構建以pcDNA-VP73為模板，采用引物P3/P4PCR擴增回收CMV-VP73并克隆于pFastBac-VSV/G中，構建重組轉移質粒pFastBac-G-VP73，經酶切鑒定及測序結果鑒定正確，繼而轉化DH10Bac大腸桿菌，大腸桿菌Bacmid中LacZ基因由于CMV-VP73表達盒的插入而失活從而篩選純化重組穿梭載體Bacmid-G-VP73。分別提取重組桿狀病毒與野生型病毒BacmidDNA，利用VP73基因上游引物P1和M13下游引物進行PCR擴增，瓊脂糖凝膠電泳結果顯示Bacmid-G-VP73PCR產物大小約1800bp，而野生型病毒Bacmid對照無擴增條帶，與預期結果一致，表明CMV-VP73已經整合重組到桿狀病毒的Bacmid中。

2.3重組桿狀病毒AcNPV-G-VP73的制備利用脂質體介導的轉染法，將新鮮提取的重組穿梭載體BacmidDNA轉染Sf9昆蟲細胞，28℃培養72h，收取上清液即含有重組桿狀病毒AcNPV-G-VP73。我國以桿狀病毒為載體在其受納的昆蟲細胞中對ASFV蛋白真核表達的研究已有報道[6-7]，但利用桿狀病毒對ASFV蛋白在哺乳動物細胞中的真核表達卻鮮有報道。本研究中CMV-IE啟動子啟動VP73基因在哺乳動物細胞中表達，限制其在常規桿狀病毒受納的昆蟲細胞中表達，同時利用VSV/G蛋白膜融合的活性避免病毒基因組被哺乳動物細胞內的補體滅活，病毒培養達到較高的滴度時，Sf9細胞即出現明顯的融合現象。

2.4重組桿狀病毒AcNPV-G-VP73介導VP73基因在哺乳動物細胞中的表達將重組病毒AcNPV-G-VP73以100MOI感染BHK-21細胞，48h后收集細胞蛋白，westernblot分析，該蛋白能夠與抗VP73的特異性MAb反應，出現一條約為45ku的目的蛋白帶，而正常BHK-21細胞和以相同感染復數AcN-PV-G-EGFP感染的BHK-21的細胞裂解蛋白均無此特異性條帶(圖2)，結果表明VP73蛋白在哺乳動物細胞中得到了表達，特異性較強。鑒于目前國內外尚無有效的疫苗用于ASF防控，而且在國內禁止引進外來病毒，無法建立該病的血清學檢測技術的情況下，本研究所構建的以桿狀病毒為載體的疫苗對于預防未來可能發生的ASF具有明顯的現實意義。綜上所述，本研究開展了ASF的相關儲備性研究，構建了能夠在哺乳動物細胞中表達ASFVVP73蛋白的重組桿狀病毒，為ASF疫苗的研究及檢測方法的建立奠定了基礎。

作者：靳雯雯楊曉紅朱碧波呂建強曹勝波單位：華中農業大學動物醫學院深圳出入境檢驗檢疫局動植物檢驗檢疫技術中心