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《中國預防獸醫學報》2014年第八期

1材料和方法

1.1拯救病毒電鏡觀察將固定于2.5%戊二醛溶液的rH4AGtB、rH4AH4B及rH4AHuB法氏囊組織進行冰凍切片觀察，以觀察切片組織中是否存在晶格樣排列的病毒粒子。

1.2拯救病毒RT-PCR鑒定從拯救病毒的法氏囊組織中提取RNA，并進行反轉錄，分別利用引物AU/F6VP2Q1512L(5''''-GGATACGATCGGTCTGACCCCGGGGGAGTC-3''''/5''''-CTTCAGGGGAGAGTTGAGGTC-3'''')、BU/B1344L(5''''-GGATACGATGGGTCTGACCCTCTGGGA-3''''/5''''-TCTAGGTCAATTGAGTACCAC-3'''')進行A和B節段擴增，將擴增產物測序分析。

1.3拯救病毒ELD50的測定以PBS將拯救的病毒10倍遞次稀釋，選取10-2～10-76個稀釋度，分別接種9日齡SPF雞胚絨毛尿囊膜，每個稀釋度接種5個雞胚，連續培養觀察7d，剔除24h內死亡的雞胚，按Reed-Muench法計算接種其ELD50。

1.4動物試驗設計將3周齡SPF雞隨機分為4個組，每組15只。試驗組1～3分別接種103ELD50的rH4AGtB、rH4AH4B、rH4AHuB，對照組接種相同體積的DMEM。接毒后7d內，每天觀察實驗雞的臨床癥狀，記錄各試驗組接種雞的死亡情況，計算其死亡率。接毒后第7d，迫殺各組雞只，觀察法氏囊病變，稱取每只雞的體重及囊重，計算囊指數(BBIX)；取部分法氏囊組織用10%中性福爾馬林固定，進行病理組織學分析。提取接毒后第4d收集法氏囊組織的RNA，進行病毒含量的測定。

2結果

2.1拯救病毒法氏囊眼觀病變將含有ibdv的A和B節段的重組質粒以不同組合轉染DF1細胞72h后，再接種于SPF雞的法氏囊中，與對照組相比，rH4AGtB、rH4AH4B和rH4AHuB接種雞法氏囊出現明顯萎縮現象，個別法氏囊呈“紫葡萄”樣，法氏囊內有明顯的出血斑點，含有大量粘液或炎性滲出物(圖略)。

2.2拯救病毒電鏡觀察利用電子顯微鏡觀察rH4AGtB、rH4AH4B和rH4AHuB感染雞法氏囊組織制備的冰凍切片，均可以在視野中觀察到IBDV病毒粒子呈“晶格”樣排列(圖2)。

2.3拯救病毒RT-PCR檢測以rH4AGtB、rH4AH4B和rH4AHuB接種雞法氏囊中提取RNA反轉錄產物為模板，擴增獲得預期大小為1400bp、1340bp的IBDVA和B節段部分片段(圖略)。測序顯示：拯救病毒基因組序列與構建克隆序列完全一致。

2.4拯救病毒ELD50的測定測定結果表明，rH4AH4B、rH4AHuBELD50相同，均為107.5/mL，第4d為兩者的死亡高峰期，rH4AH4B死亡雞胚數量為10枚，rH4AHuB為13枚；另外，rH4AHuB10-2～10-4稀釋度的雞胚接種后第4d全部死亡，但rH4AH4B僅10-2稀釋度的雞胚全部死亡。rH4AGtBELD50為105.33/mL，該病毒引起接種雞胚死亡時間有所推遲，接種后第6d、第7d仍有雞胚死亡。

2.5拯救病毒體內復制滴度的測定與3個試驗組相比，對照組中未檢測到任何IBDVRNA拷貝數，與實際相符。rH4AH4B、rH4AHuB試驗組RNA的拷貝數高于rH4AGtB，但前者與rH4AGtB無明顯差異(p>0.05)，后者與rH4AGtB之間存在明顯差異(p<0.05)。

2.6拯救病毒試驗雞囊指數(BBIX)rH4AGtB、rH4AH4B、rH4AHuB3個試驗組接種雞BBIX均低于0.7(圖4)，表明其法氏囊均出現嚴重的萎縮現象，但各試驗組之間的BBIX無明顯差異(p>0.05)。

2.7拯救病毒對雞法氏囊組織病理學變化rH4AGtB、rH4AH4B和rH4AHuB3個試驗組接種雞法氏囊均出現明顯的病理變化，淋巴濾泡內淋巴細胞壞死崩解或消失，多數濾泡內淋巴細胞消失不見，間質小血管嚴重淤血，成纖維細胞增生，其病理組織學打分(HBLS)均在4以上(圖5)。對照組法氏囊無明顯病理變化，其HBLS為1。

2.8拯救病毒對SPF雞的致死率rH4AGtB、rH4AH4B、rH4AHuB均能引起接種雞死亡，但每組死亡雞的數目及死亡時間不同。rH4AHuB接種雞第3d為死亡高峰期，5d后不再死亡，其對SPF雞的致死率高達80%。rH4AH4B接種雞死亡高峰期有所推遲，第4d為其死亡高峰期，其對SPF雞的致死率為73.3%。rH4AGtB接種雞死亡的數量明顯低于rH4AH4B和rH4AHuB，對SPF雞的致死率僅為33.3%。

3討論

IBDV早期研究認為，B節段或其編碼的VP1蛋白與IBDV的毒力無關。Islam等認為，具有多功能酶活性的VP1可以通過影響IBDV的復制，進而影響病毒的毒力及致病性[11]。LeNouen等發現A節段源于強毒，而B節段源于非強毒的病毒比B節段源于強毒的病毒毒力要低。Liu等也證明了VP1蛋白與病毒的毒力有關。本研究將IBDVHLJ0504超強毒株的A節段分別與3個亞群B節段進行組合，拯救了3種重組病毒rH4AGtB、rH4AH4B和rH4AHuB。接種雞法氏囊冰凍切片觀察，3種重組病毒在接種雞法氏囊內呈包涵體形式。RT-PCR檢測結果表明，拯救病毒基因組序列中不存在任何點突變。體內復制滴度檢測結果表明，rH4AH4B、rH4AHuB試驗組復制滴度高于rH4AGtB，但前者與rH4AGtB沒有明顯差異(p>0.05)，后者與rH4AGtB之間存在明顯差異(p<0.05)。這與之前研究結果一致，強毒來源的VP1對于病毒在體外的復制能力存在負效應，對體內的復制則存在正效應。HuB-1株及HLJ0504株的B節段在遺傳進化分析中分別處于第Ⅲ亞群和第Ⅱ亞群，這兩個亞群均為vvIBDV；Gt株的B節段則處于第Ⅰ亞群(non-vvIBDV亞群)，因此在具有相同A節段的情況下，包含第Ⅱ、Ⅲ亞群B節段的rH4AH4B、rH4AHuB體內復制能力更強，而包含第Ⅰ亞群B節段的rH4AGtB體內復制能力較弱。rH4AGtB、rH4AH4B和rH4AHuB對接種雞產生明顯的致病性。接種雞法氏囊嚴重萎縮；病理切片觀察，接種雞法氏囊有明顯的病理變化，多數濾泡內淋巴細胞消失，其HBLS均在4以上；而且3種重組病毒均能引起接種雞的死亡，rH4AHuB引起雛雞死亡率為80%、rH4AH4B次之為73.3%、而rH4AGtB僅為33.3%。rH4AHuB接種雞第3d為死亡高峰期，5d后不再死亡，其對SPF雞的致死率高達80%。rH4AH4B接種雞死亡高峰期有所推遲，第4d為其死亡高峰期，其對SPF雞的致死率為73.3%。rH4AGtB接種雞死亡的數量明顯低于rH4AH4B和rH4AHuB，對SPF雞的致死率僅為33.3%。以上結果表明，IBDVB節段影響病毒的致病性，第Ⅱ、Ⅲ亞群的B節段使IBDV的致病性增強，而第Ⅰ亞群的B節段則使IBDV的致病性減弱。

該研究結果與之前研究一致，LeNouen等對一株自然分離毒株分析報道，該分離毒株的A節段來源于vvIBDV，B節段來源于非強毒株，結果表明與完全vvIBDV相比，該分離毒株對SPF雞的致病性大大降低。但與Boot等研究有所不同，Boot等拯救了一株其A節段來源于弱毒，而B節段來源于vvIBDV的重組病毒，研究表明該重組病毒不能引起接種雞的臨床癥狀，更不可能引起接種雞的死亡。綜上所述，IBDVB節段影響病毒的致病性，不同亞群B節段對IBDV致病性的影響作用不同。其中，第Ⅱ、Ⅲ亞群B節段能夠提高病毒在體內的復制能力，從而使IBDV的致病性增強，而第Ⅰ亞群的B節段則降低了病毒在體內的復制能力，使IBDV的致病性減弱。然而，不同亞群B節段影響病毒復制及致病性的分子機制還有待于進一步研究。

作者：高立李凱祁小樂高玉龍高宏雷王永強孔憲剛王笑梅單位：中國農業科學院哈爾濱獸醫研究所獸醫生物技術國家重點實驗室/禽免疫抑制病科技創新團隊