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摘要:目的采用指紋圖譜與系統(tǒng)聚類分析方法評(píng)價(jià)不同產(chǎn)地旱田草的質(zhì)量。方法采用PhenomenexC18色譜柱(250mm×4．60mm，5μm)，流動(dòng)相為乙腈－0．2%磷酸水溶液，梯度洗脫，檢測波長334nm，柱溫30℃;建立旱田草藥材的HPLC指紋圖譜，對14批藥材進(jìn)行相似度評(píng)價(jià)，并進(jìn)行聚類分析。結(jié)果14批旱田草藥材HLPC指紋圖譜的精密度、重復(fù)性及穩(wěn)定性的RSD均＜3%，指紋圖譜的相似度均＞0．96;14批旱田草總共可聚為5類。結(jié)論HPLC指紋圖譜與聚類分析相結(jié)合，數(shù)據(jù)穩(wěn)定可靠，方法簡便高效，可為旱田草的質(zhì)量評(píng)價(jià)提供參考。

關(guān)鍵詞:廣西;壯藥;旱田草;高效液相色譜法;相似度;指紋圖譜;聚類分析;質(zhì)量評(píng)價(jià)

旱田草來源為參科植物旱田草Linderniaruellioides(Colsm．)Pennell．的干燥全草［1］，具有解毒、消腫、理氣、活血的功效，主治閉經(jīng)、痛經(jīng)、月經(jīng)不調(diào)、乳癰等病癥。分布于中國西南地區(qū)，在廣西主要分布于南寧、柳州、融水、靈川、岑溪等地［2］，生于草地、平原、山谷、林下［3］，在兩廣一帶具有一定的使用歷史，為廣西民間常用壯藥之一。關(guān)于旱田草的研究較少，僅有顯微鑒別、生藥學(xué)、定性定量及質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)等方面的研究［4－6］，未見其指紋圖譜研究。為了完善旱田草的質(zhì)量控制，合理開發(fā)利用廣西本土藥材資源，現(xiàn)采用HPLC法建立旱田草的指紋圖譜，并進(jìn)行聚類分析，為其質(zhì)量控制提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1實(shí)驗(yàn)部分

1.1儀器與試藥1260高效液相色譜儀(美國Agilent)。14批旱田草，經(jīng)蔡毅教授鑒定為玄參科植物旱田草Linderniaruellioides(Colsm．)Pennell．的全草，藥材干燥處理后，粉碎，統(tǒng)一過3號(hào)篩，備用;毛蕊花糖苷對照品(中國藥品生物制品檢定所，批號(hào):111530－201310);甲醇、乙腈為色譜純;水為超純水;其余試劑為分析純。

1.2方法與結(jié)果1.2.1溶液的制備精密稱定0．3840mg毛蕊花糖苷對照品，用甲醇定容至1mL，得0．384mg•mL－1對照品溶液。精密稱定0．4g旱田草藥材粉末，加入25mL70%甲醇，稱重，超聲處理(功率250W、頻率40kHz)30min，放冷至25℃，用提取溶劑補(bǔ)足失重，定性濾紙濾過，取續(xù)濾液，于1．3×104r•min－1離心，即得供試品溶液。1.2.2色譜條件采用PhenomenexC18色譜柱(250mm×4．6mm，5μm)，流動(dòng)相為乙腈(A)－0.2%磷酸水溶液(B)，梯度洗脫(0～5min、5%～15%A，5～45min、15%～15．5%A，45～55min、15.5%～26．5%A，55～70min、26．5%～30%A，70～75min、30%～35%A)，檢測波長334nm，柱溫30℃，進(jìn)樣量10μL。吸取10μL甲醇溶液進(jìn)樣，在色譜條件下進(jìn)行測定，結(jié)果空白溶液基線平穩(wěn)，無雜質(zhì)，無干擾。1.2.3精密度、重復(fù)性與穩(wěn)定性試驗(yàn)精密稱定0．4g8號(hào)藥材，按“1．2．1”項(xiàng)方法提取樣品，按“1.2.2”項(xiàng)色譜條件進(jìn)樣測定，連續(xù)進(jìn)樣6針。結(jié)果各峰RT的RSD為0．05%～0．19%，各峰RA的RSD為0．17%～1．88%，表示該實(shí)驗(yàn)儀器的準(zhǔn)確性良好。精密稱定8號(hào)實(shí)驗(yàn)藥材粉末6份各0．4g，按“1．2．1”項(xiàng)方法制備樣品，按“1．2．2”項(xiàng)色譜條件進(jìn)樣測定，記錄圖譜。結(jié)果6份旱田草中各峰RT的RSD為0．03%～0．46%，各峰RA的RSD為0.59%～2．36%，說明該實(shí)驗(yàn)方法的數(shù)據(jù)可靠，重復(fù)性良好。精密稱定8號(hào)藥材粉末，按“1.2.1”項(xiàng)方法制備樣品，按“1．2．2”項(xiàng)色譜條件，于樣品制備后0、2、4、8、12、24、36h時(shí)進(jìn)樣10μL，進(jìn)行測定。計(jì)算得各峰相對保留時(shí)間的RSD為0．03%～0.74%，各峰相對峰面積的RSD為0．21%～2．71%，說明旱田草樣品溶液在36h內(nèi)相對穩(wěn)定。1.2.4指紋圖譜的匹配圖與相似度分析精密稱定14批的樣品粉末各0．4g，按“1．2．1”項(xiàng)方法制備樣品溶液，按“1．2．2”項(xiàng)色譜條件，進(jìn)樣測定，采集圖譜，將14批旱田草的色譜數(shù)據(jù)導(dǎo)入《中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)2012版》軟件中，計(jì)算相似度，14批旱田草圖譜的相似度見表1，匹配圖見圖1。15個(gè)共有峰的匹配情況見表2(匹配數(shù)目均為14，保留時(shí)間的RSD均為相同)。1.2.5對照圖譜及共有峰采用《中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)2012版》軟件進(jìn)行自動(dòng)匹配，結(jié)果標(biāo)定了15個(gè)共有峰，匹配數(shù)目為14。選擇8號(hào)圖譜為參照圖譜，采用中位數(shù)法，時(shí)間寬度為0．5min，建立旱田草的對照指紋圖譜(圖2)。峰面積＞5%的共有峰為:6號(hào)、7號(hào)、9號(hào)、11號(hào)、12號(hào)，其中12號(hào)峰為毛蕊花糖苷，標(biāo)定為參照峰S，其余特征峰以1、2、3……N進(jìn)行標(biāo)定。以參照峰S的峰面積和保留時(shí)間作為1，計(jì)算共有峰的相對峰面積和相對保留時(shí)間。1.2.6系統(tǒng)聚類分析運(yùn)用IBMSPSSStatistics19．0軟件對14批旱田草的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行系統(tǒng)聚類分析，組間聯(lián)接法，Euclidean距離為度量標(biāo)準(zhǔn)。分析結(jié)果見圖3。

2討論

曾考察了不同色譜柱(InertsilODS－3、PhenomenexC18、Diamonsil)、流動(dòng)相系統(tǒng)(甲醇－水、乙腈－水、甲醇－0．2%磷酸水、乙腈－0．2%磷酸水)、檢測波長(210、254、334、360nm)、提取方法(回流、超聲、冷浸)、提取溶劑(50%甲醇、50%乙醇、70%甲醇、70%乙醇、甲醇、無水乙醇)、提取時(shí)間(90、60、30min)等分離結(jié)果的影響。結(jié)果表明:PhenomenexC18所得色譜圖峰信息量多，峰形較好;635華西藥學(xué)雜志第33卷；乙腈－0．2%磷酸水所得圖譜的基線平穩(wěn)，分離度好，峰信息多且峰面積高;在334nm條件下，基線均較平穩(wěn)，峰信息量多且峰形好;以超聲及回流提取所得樣品的色譜峰高和峰面積較冷浸提取高，考慮操作簡便，以超聲提取為佳;采用70%甲醇提取時(shí)，各色譜峰基線平穩(wěn)，峰面積較高，分離度較好;顯示各特征峰的峰高和峰面積無明顯變化，從人力、物力方面考慮，選擇提取時(shí)間為30min為佳。14批旱田草藥材通過《中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)2012版》軟件進(jìn)行相似度計(jì)算，相似度均＞0．96，符合指紋圖譜的要求，建立了旱田草指紋圖譜共有模式，標(biāo)定了共有峰15個(gè)，匹配數(shù)目為14。14批藥材的聚類結(jié)果:S3、S9、S12均單獨(dú)為一類;S4、S7、S8、S11、S14聚為一類;S1、S2、S5、S6、S10、S13聚為一類，共5類。由于S3藥材所含毛蕊花糖苷的含量為14批次中最低，且共有峰峰面積均較小，原因可能是其被單獨(dú)分為一類;S9、S12與各產(chǎn)地均未有聚合，不同產(chǎn)地的藥材存在地域差異性，但S9、S12均于10月份采自來賓市，卻未聚為同一類，其可能原因是S9藥材已儲(chǔ)藏一年，導(dǎo)致多個(gè)共有峰A相差較大而被單獨(dú)各聚為一類;S4、S7、S8、S11、S14均來自桂平市，產(chǎn)地差異較小，相似度較高，被聚為同一類;S1、S6、S10、S13均采于河池大化，地域差異不大故聚為一類，S2、S5的3～11號(hào)共有峰面積之和/本產(chǎn)地總峰面積≈S1、S6、S10、S13的3～11號(hào)共有峰面積之和/本產(chǎn)地總峰面積，相差較小而與之聚為同一類;由于地理環(huán)境(土壤、光照、濕度等)或其他因素導(dǎo)致壯藥旱田草的含量及圖譜存在一定的差異性，有待研究。利用HPLC指紋圖譜結(jié)合各特征峰的含量變化來監(jiān)測與控制藥材的質(zhì)量是可取的，比單純測定藥材中某單一組分的含量更能全面客觀的反映藥材的內(nèi)在質(zhì)量。聚類分析法應(yīng)用于藥材的鑒別、分類及中成藥成分分析。HPLC指紋圖譜與聚類分析相結(jié)合，數(shù)據(jù)穩(wěn)定可靠，方法簡便高效，可為旱田草質(zhì)量的品質(zhì)評(píng)價(jià)、真?zhèn)舞b別及質(zhì)量控制提供參考。

參考文獻(xiàn):

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作者：謝鳳鳳 黎理 唐玉榮 曾祥燕 蔡毅 單位：廣西中醫(yī)藥大學(xué)