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《中華中醫(yī)藥雜志》2014年第七期

一、軟骨細胞凋亡調控軟骨退變的作用機制

細胞凋亡（細胞程序性死亡）是一個主動的、信號依賴的過程，并由基因控制的主動的、高度有序的死亡過程。在正常情況下，軟骨細胞也存在著凋亡的現(xiàn)象，軟骨細胞凋亡對維持關節(jié)軟骨的形態(tài)結構及功能發(fā)揮重要的調控作用。不同年齡組動物關節(jié)軟骨中細胞凋亡程度與年齡增長有關，軟骨細胞的凋亡在成熟關節(jié)軟骨形態(tài)結構的維持、再建和更新過程中也發(fā)揮重要的調控作用。若軟骨細胞的凋亡超出一定的范圍，會導致軟骨細胞數(shù)量減少，軟骨細胞數(shù)量的變化不僅引起軟骨基質合成與分泌的減少，而且還能引起維持軟骨基質合成與降解酶系統(tǒng)平衡的紊亂，最終引起軟骨基質的質與量發(fā)生變化，軟骨基質的這種變化又會促進軟骨細胞的凋亡，從而導致軟骨退變。目前研究表明，線粒體凋亡、內質網應激性凋亡、細胞自噬在OA的發(fā)病過程中發(fā)揮重要的調控作用。

1.軟骨細胞線粒體凋亡信號通路與軟骨退變的關系軟骨退變是OA發(fā)生發(fā)展的一個重要因素，出現(xiàn)軟骨細胞數(shù)減少、抗氧化防御能力下降、生長因子和細胞因子免疫應答改變及基因和蛋白表達模式改變等。促凋亡與抗凋亡信號之間的失衡是介導軟骨細胞凋亡的關鍵，各種因素引起的凋亡信號傳至軟骨細胞內的作用位點，激活靶分子而產生酶級聯(lián)效應，誘導細胞凋亡，線粒體凋亡通路是軟骨細胞凋亡的重要途徑之一。線粒體具有傳遞電子、氧化磷酸化、能量代謝、貯存Ca2+、抗活性氧化等重要生理作用。線粒體功能障礙時生成活性氧，過多的活性氧可引起線粒體損傷，從而釋放促凋亡因子，導致細胞凋亡。活性氧可作用于線粒體內膜通透改變孔道（permeabilitytransitionpore，PTP），加速PTP開放，釋放細胞色素C（cytochromeC，CytoC）促進軟骨細胞凋亡，而釋放的CytoC又改變線粒體內電子傳遞鏈的功能，引起活性氧生成增加。正常細胞中CytoC位于線粒體內外膜之間，在電子呼吸傳遞鏈中起重要作用。當在凋亡發(fā)生時，CytoC從線粒體釋放入胞質，啟動半胱氨酸蛋白水解酶活化，與半胱氨酸蛋白酶-9前體、凋亡蛋白酶活化因子-1（Apaf-1）形成凋亡小體，并在脫氧腺苷三磷酸（deoxy-adenosinetriphosphate，dATP）輔助下激活Caspase-9；Caspase-9激活Caspase-3，活化的Caspase-3瀑布式活化Caspase-2、6、8、10，而激活的Caspases最終活化脫氧核糖核酸酶（CAD/DFF45），水解核酸及細胞骨架，引起細胞凋亡[7-8]。Bcl-2通過抑制CytoC釋放，降低活性氧生成，從而抑制凋亡。Bax為編碼Bcl-2相關蛋白X的基因，具有誘導細胞凋亡的功能，Bcl-2/Bax之間的比例是調控細胞凋亡的關鍵因素。p53位于線粒體上的轉錄因子，能上調促凋亡基因的表達，下調抗凋亡基因的表達。p53基因表達產物的聚集使Bax表達增加，進而釋放CytoC并激活Caspase，引發(fā)細胞凋亡。

2.內質網應激反應與軟骨退變的關系軟骨內無血管和神經支配，代謝主要通過滲透作用，對缺氧、鈣代謝紊亂、機械性壓力、自由基侵襲等應激因素很敏感，易發(fā)生內質網應激反應，引發(fā)內質網相關性死亡。內質網在膜蛋白的合成、修飾和折疊及維持細胞內鈣Ca2+的穩(wěn)定等方面都發(fā)揮關鍵性作用。當機體細胞受到缺氧、饑餓、自由基侵襲及鈣代謝紊亂等應激因素刺激時，內質網腔內未折疊蛋白增多或鈣失衡，引發(fā)內質網應激反應。內質網應激感受蛋白（PEAK、ATF-6和IRE-1）介導的信號轉導不僅是糾正內質網功能紊亂的重要機制，在強烈、持久應激刺激時，內環(huán)境紊亂無法糾正，內質網應激感受蛋白則會啟動凋亡程序，誘發(fā)細胞凋亡。內質網應激引起的細胞凋亡異于其他凋亡路徑，有其自身的信號通路，稱為內質網相關性死亡途徑，此途徑包含內質網應激誘導CHOP/GADD153表達、C-JUN氨基末端激酶（JNK）活化和內質網特有的Capase-12蛋白水解酶活化。CHOP/GADD153是內質網應激特異的轉錄因子，PEAK、ATF-6和IRE-1的活化均能促進CHOP的大量產生。CHOP表達增加會下調抗凋亡蛋白Bcl-2表達，促進反應性氧中介物（ROIs）和減少細胞內谷胱甘肽生成，從而引發(fā)細胞凋亡。內質網應激時，活化的IRE1招募JNK和腫瘤壞死因子受體相關因子TRAF2，TRAF2激活細胞凋亡信號激酶1（ASK1），并形成IRE-1/TRAF2/ASK1三聚體，隨后激活JNK，誘導細胞凋亡。Caspase-12位于內質網膜上，內質網Ca2+平衡的破壞或內質網未折疊蛋白的過量積聚均會誘導Caspase-12表達，同時也導致胞質內Caspase-7轉移到內質網表面，Caspase-7激活Caspase-12，激活的Caspase-12可進一步活化Caspase-3，引發(fā)細胞凋亡。內質網上Bcl-2家族中抑凋亡蛋白則可調節(jié)網腔中游離Ca2+濃度，維持胞質內的Ca2+濃度在合適的水平，進而抑制細胞凋亡[14-15]。

3.細胞自噬與軟骨退變的關系細胞自噬（autophagy）是依賴溶酶體途徑對胞質蛋白和細胞器進行降解的一種過程，并利用降解產物提供能量和重建細胞結構，在維持細胞穩(wěn)態(tài)和細胞生命活動等方面起重要作用。細胞自噬與凋亡間的關系較為復雜，目前研究表明，自噬標志性基因ULK、Beclin1、LC3在正常的關節(jié)軟骨中有明顯表達，退變軟骨中自噬水平下降（其機制與溶酶體水解失敗密切相關），導致退變軟骨中自噬體清除減緩和毒性蛋白增加。自噬在骨關節(jié)炎軟骨細胞凋亡中更傾向于保護軟骨細胞，當細胞器受損時，細胞內自噬水平明顯升高，以清除受損的細胞器，阻止細胞凋亡啟動，但自噬過度或不足均可能導致自噬性細胞死亡[17-18]。因此，細胞自噬一方面保護細胞，另一方面則可導致自噬性細胞死亡。Atg1、Atg6、Atg8（哺乳動物中的同源物分別稱作ULK1、Beclin1、LC3）是自噬途徑的3個主要管理者，分別充當誘導者、調節(jié)者、執(zhí)行者的角色。在哺乳動物中，mTOR整合生長因子、營養(yǎng)分子、氨基酸和能量感受信號，調控細胞生長、增殖、營養(yǎng)運輸、蛋白合成和自噬。細胞內營養(yǎng)缺乏時，mTOR活性受抑制，導致Atg家族成員激活，從而促進自噬泡形成；細胞內營養(yǎng)充足時，mTOR激活，從而抑制細胞自噬的發(fā)生。死亡相關蛋白激酶（DAPK）也是細胞自噬的重要調節(jié)因子，可使微管相關蛋白（MAP）1B磷酸化，進而使MAP1輕鏈3（LC3）-Ⅱ與自噬體膜結合。自噬蛋白Beclin1的BH3結構域與DAPK相互作用，可使BH3結構域磷酸化，從而阻斷Beclin1與凋亡基因Bcl-2和凋亡抑制基因Bcl-xL相互作用，促進自噬發(fā)生。

二、獨活寄生湯干預軟骨細胞凋亡的機制

軟骨細胞凋亡原因是多方面的，但最終都離不開凋亡相關因子的參與和調節(jié)。肝腎虧虛證存在不同程度的下丘腦-垂體-靶腺（腎上腺、甲狀腺、性腺及胸腺）軸功能紊亂，影響機體的神經-內分泌-免疫系統(tǒng)功能，從而產生一系列的臨床癥狀及體征。補腎柔肝藥能多方位調節(jié)下丘腦-垂體-靶腺軸及神經-內分泌-免疫網絡系統(tǒng)的功能，調節(jié)異常的細胞因子水平，上調性激素水平，保護軟骨細胞，調節(jié)軟骨基質的降解，參與調控軟骨退變；補腎柔肝、祛風活血藥通過影響凋亡信號通路，抑制促凋亡基因并促進抗凋亡基因的表達，從而抑制軟骨細胞凋亡和促進增殖。因此，獨活寄生湯作用機制可能是通過調節(jié)神經-內分泌-免疫系統(tǒng)、神經-內分泌-骨代謝系統(tǒng)的功能，調節(jié)線粒體功能、內質網應激反應、細胞自噬水平是獨活寄生湯干預軟骨細胞凋亡的重要作用途徑。

作者：劉發(fā)元李西海葉蕻芝劉獻祥單位：福建中醫(yī)藥大學中西醫(yī)結合研究院