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禽白血病是由禽白血病病毒(Avianleukosisvirus，ALV)引起的禽類多種腫瘤性疾病的統(tǒng)稱。ALV屬于反轉(zhuǎn)錄病毒科，禽C型反轉(zhuǎn)錄病毒屬。根據(jù)病毒感染的宿主范圍、干擾譜和囊膜抗原，可以將ALV進(jìn)一步區(qū)分為A至G7個亞群。J亞群ALV(ALV-J)最早于1988年在英國分離得到[2]。1999年中國首次報道ALV-J的出現(xiàn)，繼而中國大部分地區(qū)相繼出現(xiàn)ALV感染的報道[3-5]。ALV大范圍的流行給我國養(yǎng)禽業(yè)造成了嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失[6]。目前，該病的主要預(yù)防方法為淘汰陽性雞，選育出無白血病雞群以凈化種群[7]。因此，該病的準(zhǔn)確診斷尤為重要。本實驗利用原核表達(dá)的重組衣殼蛋白(p27蛋白)免疫小鼠，通過雜交瘤技術(shù)最終獲得一株抗p27蛋白的單克隆抗體(MAb)。并通過對p27蛋白的截短表達(dá)，確定了該MAb識別的抗原表位，為禽白血病病原檢測方法的建立提供了有利的工具。

1材料和方法

1.1病毒株、細(xì)胞和實驗動物ALV-JHPRS103株、ALV-ARAV-1株和ALV-BRAV-2株均由英國Pirbright研究所DrNair惠贈；DF-1、S/P20細(xì)胞由本實驗室保存；6周齡BALB/c雌鼠由本研究所實驗動物中心提供。

1.2主要試劑大腸桿菌(E.coli)DH5α和BL21感受態(tài)購自天根生化科技(北京)有限公司；pET-30a質(zhì)粒由本實驗室保存；PEG-4000、HPR標(biāo)記的羊抗鼠IgG(IgG-HRP)、羊抗鼠IgG-FITC購自Sigma公司；抗體亞類鑒定試劑盒購自賽默飛公司；蛋白純化用材料購自GEhealthcare。

1.3重組表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建及目的蛋白的表達(dá)根據(jù)ALV-JHPRS103株的序列(Z46390)設(shè)計一對引物5'-CACGAATTCAGCGCCTGCTACGGTGGTGACCC-3'(EcoRⅠ)/5'-ACTCTCGAGGGAGTTCATCTATTGCAACAACCAG-3'(XhoⅠ)。經(jīng)PCR擴(kuò)增p27目的基因，通過EcoRⅠ/XhoⅠ雙酶切后克隆于pET-30a中，構(gòu)建重組表達(dá)質(zhì)粒pET-p27。將其轉(zhuǎn)化BL21E.coli感受態(tài)細(xì)胞中，經(jīng)IPTG誘導(dǎo)表達(dá)，制備p27重組蛋白，按照文獻(xiàn)[8]方法對重組蛋白進(jìn)行純化。

1.4動物免疫及細(xì)胞融合將純化的p27蛋白與等體積的弗氏完全佐劑乳化，對小鼠(100μg/只)進(jìn)行頸背部皮下注射。兩周后，以弗氏不完全佐劑乳化的p27蛋白對小鼠進(jìn)行加強(qiáng)免疫。間隔兩周，用二免同樣的方法進(jìn)行第3次免疫。三免后21d，用純化的p27蛋白(100μg/只)對小鼠進(jìn)行腹腔注射，3d后，取小鼠脾細(xì)胞與SP2/0骨髓瘤細(xì)胞進(jìn)行融合[9]。

1.5雜交瘤細(xì)胞的篩選及MAb的亞類鑒定以純化的p27蛋白作為檢測抗原，通過間接ELISA方法進(jìn)行雜交瘤細(xì)胞株的篩選。將篩選到的陽性雜交瘤細(xì)胞株利用有限稀釋法進(jìn)行克隆純化3代，直到陽性率為100%。將純化的雜交瘤細(xì)胞按文獻(xiàn)[11]的方法腹腔接種6周齡～8周齡的小鼠制備小鼠腹水MAb。并利用MAb亞型試劑盒對其進(jìn)行亞類鑒定。具體步驟參考說明書。

1.6MAb的間接免疫熒光(IFA)鑒定將ALV-A、ALV-B和ALV-J分別接種于DF-1細(xì)胞單層中，連續(xù)培養(yǎng)4d后，將細(xì)胞單層經(jīng)無水乙醇固定15min，以制備的MAb(1∶100)為一抗，羊抗鼠IgG-FITC(1∶100)為二抗，通過顯微鏡觀察進(jìn)行IFA鑒定。

1.7抗原表位的初步鑒定將p27編碼基因分成部分重疊的6段：p27-1(aa1-aa111)、p27-2(aa91-aa177)、p27-3(aa151-aa239)、p27-4(aa91-aa125)、p27-5(aa119-aa153)和p27-6(aa147-aa177)，PCR擴(kuò)增后，克隆于原核表達(dá)載體pGEX-6P-1中，陽性重組質(zhì)粒測序正確后轉(zhuǎn)化E.coliBL21，并以IPTG誘導(dǎo)進(jìn)行重組蛋白的表達(dá)。以制備的MAb作為一抗，羊抗鼠IgG-HRP作為二抗對表達(dá)的多肽進(jìn)行westernblot鑒定，初步確定p27抗原表位所在的區(qū)域。將MAb識別的p27片段繼續(xù)進(jìn)行截短表達(dá)，并采用原核表達(dá)的肽段包被96孔ELISA反應(yīng)板，以制備的MAb作為一抗，羊抗鼠IgG-HRP作為二抗檢測所表達(dá)肽段與MAb的反應(yīng)情況，從而確定p27抗原表位所在的位置。

2結(jié)果

2.1p27蛋白的原核表達(dá)、純化及鑒定以ALV-JHPRS103cDNA為模板，通過PCR擴(kuò)增p27目的基因，并通過雙酶切后克隆于pET-30a質(zhì)粒中構(gòu)建重組表達(dá)質(zhì)粒pET-p27。將pET-p27轉(zhuǎn)化E.coliBL21后，經(jīng)IPTG誘導(dǎo)獲得可溶性表達(dá)的重組p27蛋白。重組蛋白經(jīng)過純化后，SDS-PAGE檢測結(jié)果顯示其分子量為36ku，與預(yù)期結(jié)果相符。

2.2陽性雜交瘤細(xì)胞株的建立、MAb效價測定及MAb免疫球蛋白亞類鑒定以原核表達(dá)的重組p27蛋白為免疫原免疫小鼠后，將小鼠脾細(xì)胞與SP2/0骨髓瘤細(xì)胞融合，通過間接ELISA篩選陽性克隆以及3次雜交瘤細(xì)胞克隆純化，最終獲得一株持續(xù)分泌ALVp27蛋白的雜交瘤細(xì)胞株，命名為2C7。采用已建立的間接ELISA方法對2C7進(jìn)行MAb效價測定，結(jié)果顯示小鼠腹水的效價為212。其IgG亞型為IgG1/Kappa。

2.3MAb的特異性鑒定將純化的重組蛋白進(jìn)行westernblot鑒定。結(jié)果顯示，在36ku處出現(xiàn)特異性條帶，而空載體對照未出現(xiàn)相應(yīng)條帶。表明MAb2C7能夠識別ALV的衣殼蛋白p27(圖2A)。將ALV-A、ALV-B和ALV-J分別接種于DF-1細(xì)胞，未接毒的DF-1細(xì)胞作為陰性對照。接毒后4d以MAb2C7作為一抗，進(jìn)行IFA試驗。IFA試驗結(jié)果表明，制備的MAb2C7與ALV-A，ALV-B和ALV-J均呈陽性反應(yīng)(圖2B)，表明該MAb能夠與不同亞群的ALV反應(yīng)。

2.4MAb線性抗原表位的鑒定將p27編碼基因分成部分重疊的6段：p27-1(aa1-aa111)、p27-2(aa91-aa177)、p27-3(aa151-aa239)、p27-4(aa91-aa125)、p27-5(aa119-aa153)和p27-6(aa147-aa177)分別克隆于pGEX-6P-1中進(jìn)行原核表達(dá)。以MAb2C7為一抗，對表達(dá)的重組蛋白進(jìn)行westernblot驗證。結(jié)果顯示，重組蛋白p27-5能夠與MAb2C7發(fā)生特異性反應(yīng)(圖3)。表明p27蛋白的抗原表位可以初步確定在aa119～aa153之間。將p27-5進(jìn)一步進(jìn)行截短表達(dá)p27-7(aa119-aa134)、p27-8(aa129-aa142)和p27-9(aa137-aa153)，利用表達(dá)的肽段包被96孔ELISA檢測板，以MAb2C7作為一抗，羊抗鼠IgG-HRP作為二抗進(jìn)行檢測。結(jié)果表明多肽p27-8能夠與MAb2C7發(fā)生特異性反應(yīng)(圖4)。結(jié)果表明p27蛋白的抗原表位可以進(jìn)一步確定為129LVAITASALQAFRE142。氨基酸序列比對結(jié)果顯示，本研究鑒定的p27線性表位在ALV-A、ALV-B和ALV-J亞群之間高度保守。因此，該表位對于ALV群特異性抗原檢測試劑盒的研究具有重要意義。

3討論

p27蛋白是病毒衣殼蛋白，在外源性ALV-A、ALV-B和ALV-J各亞群間同源性高達(dá)90%，含量高，占病毒總蛋白成分的30%以上，是制備檢測抗體的首選抗原，對禽白血病的診斷具有重要意義。本研究將p27蛋白進(jìn)行原核表達(dá)，原核表達(dá)系統(tǒng)操作簡單，蛋白表達(dá)量高并且成本低。采用純化的原核表達(dá)蛋白作為免疫原免疫6周齡BALB/c雌鼠，最終篩選得到一株MAb2C7。Westernblot鑒定表明MAb2C7能夠識別ALV衣殼蛋白p27。IFA試驗表明MAb2C7能夠與家禽中常見的ALV亞群：A、B和J亞群病毒發(fā)生特異性反應(yīng)，這表明該MAb與不同亞群ALV具有良好的反應(yīng)活性，為禽白血病病原學(xué)診斷方法的建立提供了有利的工具。P27蛋白作為ALV的群特異性抗原，因為其序列保守并且含有許多抗原性強(qiáng)表位而成為制備檢測抗體的首選抗原，對禽白血病的診斷具有重要意義。然而，目前對于p27蛋白抗原表位的分析很少。

確定蛋白上特異的抗原決定簇位點是研究蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)和功能的重要方法并且已經(jīng)應(yīng)用到疾病診斷和表位疫苗的研究中[11-13]。本研究通過對p27蛋白進(jìn)行截短表達(dá)，確定了其抗原表位位于129LVAITASALQAFRE142。氨基酸序列比對結(jié)果顯示，本研究所鑒定的p27表位在ALV各亞群之間高度保守。因此，該表位對于ALV群特異性抗原檢測試劑盒的研究具有重要意義。本研究所制備的MAb2C7以及對p27抗原表位的分析為ALV感染的檢測、p27蛋白功能研究以及研發(fā)新的禽白血病ELISA抗原檢測試劑盒提供了有利的工具。

作者：李曉菲 朱海波 高奇 王琦 孫佳善 高玉龍 祁小樂 王永強(qiáng) 高宏雷 王笑梅 單位：中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院哈爾濱獸醫(yī)研究所 獸醫(yī)生物技術(shù)國家重點實驗室 禽免疫抑制病科技創(chuàng)新團(tuán)隊 哈爾濱動物用生物制品國家工程研究中心有限公司 江蘇省動物重要疫病與人畜共患病協(xié)同創(chuàng)新中心