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第1篇

【關鍵詞】泡桐屬;化學成分;生物活性

玄參科泡桐屬Paulownia植物,全屬共有7種,分別是白花泡桐[P.fortunei(Seem.)Hemsl.],毛泡桐[P.tomentosa(Thunb.)Steud.],蘭考泡桐(P.elongataS.Y.Hu),椒葉泡桐(P.catalpifoliaGongTong),臺灣泡桐(P.kawakamiiIto),川泡桐(P.fargesiiFranch.)和南方泡桐(P.australisGongTong),光泡桐[P.tomentosavar.tsinlingensis(Pai)GongTong]是毛泡桐的變種。除東北北部、內蒙古、新疆北部、等地區(qū)外全國均有分布,栽培或野生。白花泡桐在越南、老撾也有分布,有些種類已在世界許多國家引種栽培。作為一種優(yōu)質木材,它不僅在工農業(yè)方面有廣泛用途,同時它還是一種常用的中草藥,其花、葉、皮、根、果古時就有其藥用記載。如《本草綱目》記述:“桐葉……主惡蝕瘡著陰,皮主五痔,殺三蟲?；ㄖ鞲地i瘡,消腫生發(fā)[1]?！薄端幮哉摗芬惭?“治五淋,沐發(fā)去頭風,生發(fā)滋潤。”近年來醫(yī)學研究發(fā)現(xiàn)其主要作用有:抗菌消炎,止咳利尿,降壓止血,同時還具有殺蟲作用。

1化學成分

泡桐屬植物的化學成分研究始于20世紀30年代初。日本學者最先對泡桐屬植物的化學成分進行了研究,1931年MascoKazi等從泡桐葉的樹皮和樹葉中分離得到糖苷類化合物[2,3]。1959年,KazutoruYoneichi研究了桐木中的木脂素成分,分離得到了丁香苷。隨著科學技術的發(fā)展,各種色譜分離方法和現(xiàn)代波譜技術應用于天然產物的研究,從泡桐屬植物中不斷發(fā)現(xiàn)新化合物。該屬植物中所含化學成分類型主要有環(huán)烯醚萜苷、苯丙素、木脂素苷、黃酮、倍半萜、三萜等。其中許多化合物被證明具有一定的生物活性。

1.1苯丙素類化合物苯丙素類化合物在泡桐屬植物中分布較為廣泛。主要有:(1)木脂素(四氫呋喃駢四氫呋喃類):細辛素(d-Asarinin)[4],芝麻素(d-Sesamin)[5],泡桐素(Paulownin)[6],異泡桐素(Isopaulownin)、(+)-Piperitol[7]等。(2)苯丙素酚類:Verbascoside[8],Isoverbascoside[9]。

1.2環(huán)烯醚萜類富含環(huán)烯醚萜類成分是泡桐屬植物的一大特征,在該屬植物中多以成苷的形式出現(xiàn),廣泛分布于桐木、桐皮、桐葉中,花中還未見文獻報道。泡桐屬中的環(huán)烯醚萜成分具有九碳骨架(即C-4去甲基)的環(huán)戊烷型、環(huán)戊烯型和7,8環(huán)氧戊烷型,顯示了其在植物分類學上的意義。其取代基位置比較固定,一般1位羥基與1分子葡萄糖成苷,8位為甲基或羥甲基。另外,Soern等從成年毛泡桐的葉部獲得兩個5,6位為雙鍵的環(huán)烯醚萜苷,同時,他還發(fā)現(xiàn)成年和幼年的毛泡桐中環(huán)烯醚萜苷成分有所不同[10~14]。

1.3倍半萜類李志剛等[15]從毛泡桐的花中分到7個落葉酸型的倍半萜,為首次從該屬植物中分到倍半萜類化合物,可能與該類激素促進開花,抑制種子發(fā)芽有關,其他部分未發(fā)現(xiàn)。

1.4甘油酯類杜欣等[16]從毛泡桐的花中還分到了甘油酯類的化合物及其苷。

1.5其他成分從該屬植物中還分離出黃酮類、二氫黃酮類、三萜(主要為熊果酸及其苷[17])、生物堿、多酚、單糖、鞣酸、脂肪酸等多種成分。另外,栗原滕三郎和宋永芳等[18]對泡桐花的精油成分作了色譜、質譜分析,研究了其中的蛋白質、氨基酸、微量元素等營養(yǎng)成分,利用GC/MS技術鑒定出許多長鏈及芳香族化合物。

1.6植物激素王文芝等[19]對河南蘭考泡桐的根、莖、葉中的植物激素進行了研究,利用HPLC技術分離鑒定出了激動素、反式玉米素、激動素核酸等8種激素。

2生物活性

2.1抗菌作用芝麻素對結核桿菌有抑制作用[20],而泡桐花及其果實的注射液(醇提取后用醋酸鉛沉淀去雜質制成),體外實驗時對金黃色葡萄球菌及傷寒桿菌、痢疾桿菌、大腸桿菌、綠膿桿菌、布氏桿菌、革蘭菌、酵母菌等均有一定的抑制作用[4]。從泡桐屬植物中分到的紫葳新苷Ⅰ對金黃色葡萄球菌和乳鏈球菌均有抑制作用,最小濃度為150μg/ml,并認為其角甲基是抗菌必要基團[21]。魏希穎等將泡桐花的黃酮提取物作了體外抑菌實驗,發(fā)現(xiàn)其對金黃色葡萄球菌作用最強,而對黑曲霉、啤酒酵母、產黃青霉無明顯的抑制作用[22]。

2.2治療氣管炎泡桐果及花治療慢性氣管炎有一定療效,臨床治療1341例,有效率為81%,其中臨床控制率7%,顯效25%[23]。

2.3消炎作用泡桐花可用于治療炎癥感染,臨床報道用其治療16種疾病計244例,均有一定療效,其中對上感、支氣管肺炎、急性扁桃體炎、菌痢、急性腸炎、急性結膜炎的療效較好,治療中未發(fā)現(xiàn)不良反應和副作用[4]。實驗中通過觀察泡桐花浸膏對哮喘豚鼠肺病理組織學的影響發(fā)現(xiàn)泡桐花浸膏能明顯延長豚鼠誘喘潛伏期,優(yōu)于地塞米松(P<0.001);對肺組織炎性細胞浸潤有明顯的抑制作用。能減輕炎癥反應對哮喘豚鼠肺組織結構的破壞[24]。李寅超等通過實驗發(fā)現(xiàn)泡桐果總黃酮及揮發(fā)油可通過抑制支氣管肺泡灌洗液(BALF)中的血嗜酸粒細胞(EOS)聚集而具有一定的抗哮喘氣道變應性炎癥的作用[25]。

2.4止血作用泡桐屬植物中所含丁香苷有明顯止血作用。本品注射液用于手術70例,良效(明顯止血)30例,占42.9%,有效(出血減少)26例,占37.1%,無效14例[26]。

2.5毒性研究小鼠口服泡桐果乙醇提取物半數(shù)致死量為21.4g生藥/kg。大鼠口服2g/(kg·d),共21天,一般情況及體重均無異常,內臟病理檢查未見中毒性病理形態(tài)改變。家兔急性、亞急性毒理實驗中,泡桐果煎劑對心、肝、腎、脾、胃均無毒性病理改變。家兔灌服泡桐花浸膏或靜脈注射,一般情況及食欲、體重、白細胞等均無明顯變化,成人口服上述浸膏或肌肉注射,自覺癥狀、體溫、脈搏及白細胞數(shù)等均無明顯改變,但有輕度血壓下降[4]。已有報道苯丙素苷具有抗菌、抗病毒、抗腫瘤、清除自由基、延緩骨骼肌疲勞、DNA堿基修復、抗凝血、抗血小板凝聚等多種生理活性。從泡桐屬植物的樹皮和莖部分離得到一個新的呋喃醌酮(methyl-5-hydroxy-dinaphtho[1,2-2′,3′]furan-7,12-dione-6-carboxylate),對hela癌細胞有抑制作用,對polio病毒的brunhildeⅠ型EC50為0.1μg/ml對leonⅢ型EC50為0.1μg/ml[27]。另外,咖啡酸的糖酯類化合物被認為與該植物的顏色改變有關[28]。

2.6殺蟲作用泡桐素、芝麻素可增強殺蟲劑除蟲菊酯的殺蟲作用,可有效殺滅蚊蠅及其幼體[29]。

2.7其他作用泡桐屬植物還具有止咳、平喘、祛痰、治手足癬與燒傷、消腫、生發(fā)等功效[4]。

從以上可知,泡桐屬植物化學成分療效顯著且具多樣化,但對該屬植物的成分研究多集中于毛泡桐種,其他種涉及較少,而對部位的研究則多為桐葉,皮、根,莖次之,花研究的最少。對生物活性的研究則不夠深入,其有效部位及有效成分有待進一步確定。

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第2篇

TALE只在β-和γ-變形細菌中被發(fā)現(xiàn)，大部分已知的TALE集中分布在植物病原細菌的黃單胞菌屬Xantomonasspp.中，每個細菌中含有1至多個TALE不等()。AvrBs3和AvrBs4兩側分布反向重復序列，推測它們是基因水平轉移獲得(Bonasetal.,1993)。另外，水稻白葉枯黃單胞菌(X.oryzaepv.oryzae,Xoo)中利用AvrBs3作為探針鑒定了一系列TALE的T3SEs，如avrXa5、avrXa和avrXa10(Hopkinsetal.,1992)。其它菌屬中也發(fā)現(xiàn)了同源的TALE，如茄科雷爾氏菌R.solanacearum中也有TALE(RipTALs)的報道，Brg11較黃單胞菌屬中的TAL有偏好的RVDS，激活寄主含有EBE(effector-bindingelement)的基因轉錄促進致病(deLangeetal.,2013;deLangeetal.,2014)。伯克霍爾德菌屬(Burkholderiarhizoxinica)中同源效應物(bats)E5A-W45、E5AV36被報道含有T3S分泌信號，但是缺少可識別的NLSS和轉錄激活區(qū)，它們的重復區(qū)和黃單胞菌屬中的TALEs有差異(Schornacketal.,2013;Bochetal.,2014)。黃單胞菌屬(Xanthomonas)亦稱黃單胞桿菌屬，是由W.J.Dowson于1939年建立的模式病原細菌，代表種有：(1)十字花科黑腐病菌(X.campestrispv.campestris,Xcc)，維管束寄生菌，引起十字花科植物的黑腐病(blackrot)，葉緣葉脈變黑，相鄰的葉肉組織枯死，呈黃褐色“V”型壞死；(2)水稻白葉枯黃單胞菌(X.oryzaepv.oryzae,Xoo)，葉肉寄生菌，引起水稻白葉枯病(bacterialleafblight)；(3)辣椒斑點致病變種(X.campestrispv.vesicatoria,Xcv)，葉肉寄生菌，引起辣椒斑點病(bacterialspeckofpepper)。已報道的10大植物病原菌排行版上，黃單胞菌黑腐病致病變種占據(jù)3大席位(Mansfieldetal.,2012)，分別為：(1)丁香假單胞菌(Pseudomonassyringaepathovars)；(2)茄科羅爾斯通氏菌(Ralstoniasolanacearum)；(3)根癌農桿菌(Agrobac-teriumtumefaciens)；(4)黃單胞菌水稻白葉枯致病變種(Xanthomonasoryzaepv.oryzae)；(5)黃單胞菌十字花科黑腐病致病變種(Xanthomonascampestrispathovars)；(6)黃單胞菌地毯草致病變種(Xanthomonasaxonopodispathovars)；(7)解淀粉歐文氏菌(Erwiniaamylovora)；(8)苛養(yǎng)木桿菌(Xylellafastidiosa)；(9)馬鈴薯黑脛病菌Dickeya(dadantiiandsolani)；(10)果膠桿菌胡蘿卜軟腐病(Pectobacteriumcarotovorum)/黑脛病菌(Pecto-bacteriumatrosepticum)。

2.寄主抗性識別機制及TALE致病性

2.1寄主和病原菌相互作用

寄主和病原菌相互作用被認為是從PAMPs/M-AMPs(pathogenormicrobe-associatedmolecularpatt-erns)的識別開始的。病原菌的PAMPs/MAMPs相當保守，不同的PAMPs/MAMPs被定位在寄主細胞膜上的形態(tài)識別受體PRRs(patternrecognitionrecep-tors)特異性識別從而激活寄主的基礎防御反應，這對植物免疫致病菌或非致病菌相當重要(JonesandDa-ngl,2006)。研究比較清楚的PAMPs包括微生物的鞭毛組分Flg22、Harpins、冷休克蛋白、脂多糖、肽聚糖和延伸因子Tu(EF-Tu)等(Kunzeetal.,2004;Nürnbe-rgeretal.,2004;Zipfeletal.,2004)。PAMPs被PRRs識別觸發(fā)一個叫做PTI(PAMP-triggeredimmunity)的基礎防御反應，該基礎防御反應參與誘導MAPK信號通路、鈣通量、產生一氧化氮和活性氧分子和激活WRKY轉錄因子(Nürnbergeretal.,2004;Heetal.,2006)。PTI介導的基礎免疫有效地限制了絕大多數(shù)潛在的病原體的生長，是在大多數(shù)植物中廣泛存在的基礎防御反應(JonesandDangl,2006)。隨著寄主PTI的加強，病原細菌相應地進化出了效應物激活的寄主感病性ETS(effector-triggeredsusceptibility)，即利用T3SEs抑制寄主的PTI信號達到致病的目的(JonesandDangl,2006)。與病原細菌ETS(effector-triggeredsusceptibility)相對應地，寄主則又進化出了特異識別T3SEs的抗性(resistance)基因激活免疫反應，效應物激活的寄主免疫反應稱為ETI(effector-triggeredimmunity)(JonesandDangl,2006)。效應物作用和修改寄主蛋白或效應物自身被寄主抗性R蛋白(resistanceprotein)識別即誘導ETI，ETI是植物的第二級防御策略，通過胼胝質沉積加厚細胞壁、阻斷維管束的運輸、抗病相關蛋白的表達、氧自由基的釋放和細胞程序性死亡等。植物通過不斷進化的R基因響應植物致病菌的挑戰(zhàn)，提供了監(jiān)測植物病原效應物的又一途徑(Chisholmetal.,2006;MaandGuttman,2008)。由于R基因的存在，ETI改變相互作用的結果從感病回到抗病。總之，病原菌和寄主互作概括起來就是三種情況：(1)微生物引發(fā)植物的PTI，植物啟動防御系統(tǒng)，激活抗病基因的表達，如轉錄調控因子WRKY表達激活下游抗病基因表達，微生物不能引起致病，植物表現(xiàn)為抗性寄主；(2)微生物引發(fā)植物的PTI，但是微生物利用Ⅲ型效應物抑制寄主的PTI引起致病，植物表現(xiàn)為感病寄主；(3)微生物引發(fā)植物的PTI，微生物利用Ⅲ型效應物抑制寄主的PTI，寄主進化出一系列的監(jiān)守R基因抑制效應物的作用，植物表現(xiàn)為抗性寄主(Chisholmetal.,2006;MaandGuttman,2008)。

2.2植物富含LRR結構域蛋白

植物的抗性R蛋白因含有核酸結合區(qū)和富含亮氨酸重復區(qū)常歸為NB-LRR(nucleotidebinding-leuc-inerichrepeat)蛋白家族。這些特別的免疫蛋白介導不同的抗性蛋白-效應物蛋白識別過程和激活寄主潛在的防御反應NB-LRRs呈現(xiàn)多功能域結構，每個功能域依據(jù)NB-LRR信號行使不同的功能。NB-LRR的功能和相關信號的復雜度是和植物-微生物互作相對應的(Elmoreetal.,2011)。亮氨酸重復區(qū)LRRs廣泛存在于真白質中，參與蛋白-蛋白互作。一般情況下，LRR功能域包括20~29個氨基酸，其保守的11個殘基片段序列為LxxLxLxxN/cxL(x代表任意一個氨基酸,L代表纈氨酸,異亮氨酸或苯丙氨酸)(KobeandKajava,2001)。如擬南芥PRRs鞭毛識別蛋白FLS2，延伸因子識別蛋白EFR，及水稻中的R蛋白Xa21都分別包含一個胞外28LRRs、21LRRs和23LRRs的結構域(Songetal.,1995;Gómez-GómezandBoller,2000;Zipfeletal.,2006)。LRR蛋白的保守的β折疊和鄰近的松散區(qū)域是一個11個殘基的片段，其序列為LxxLxLxxN/CxL，剩下的區(qū)域可能高度不同，目前的分子模型認為20個或30個殘基長的LRR區(qū)域其核心的LxxLxL序列足以構成馬蹄形結構的蛋白質。目前，包括LRRs的蛋白至少有7個不同亞族，在許多重要的生理過程提供了形成蛋白質相互作用的一個通用的結構框架(KobeandKajava,2001)。PRRs激活的寄主免疫反應在植物和微生物的互作中發(fā)揮了重要的作用。隨著對PRRs研究的深入，值得一提的是，關于動物免疫相關的形態(tài)識別受體PRRs的發(fā)現(xiàn)贏得了2011年諾貝爾獎。許多植物抗性R蛋白及形態(tài)識別受體PRRs富含LRR(KobeandKajava,2001;Elmoreetal.,2011)。PRRs富含亮氨酸重復區(qū)LRRs(leucine-richrepeats)或細胞溶酶結構域(lysin-motif,LysM)。PRRs包含受體類激酶(re-ceptor-likekinases,RLKs)和受體類蛋白(receptor-likeproteins,RLPs)，通常RLKs為跨膜蛋白，包含胞質外受體域LRRs和胞質內激酶域2部分，RLPs沒有胞質內激酶域(Albrechtetal.,2012)。效應物的識別被認為是改變了NB-LRRs的構象，因而NB-LRR蛋白被釋放激活下游的免疫反應的信號(TakkenandTameling,2009)。研究表明，一些核定位的NBS-LRRs的積累和激活對于植物免疫反應是必需的，如大麥(Barley)的CC-NB-LRRMLA10、擬南芥(Arabidopsis)的TIR(toll-interleukin1recep-tor)-NB-LRRs/RRS1-R、RPS4和SNC1蛋白的累積和激活都是免疫反應所必需的(Deslandesetal.,2003;Burch-Smithetal.,2007;Wirthmuelleretal.,2007;Chengetal.,2009)。

2.3TALE與R基因識別

在植物-病原菌互作過程中，存在基因-基因的識別現(xiàn)象，當植物中有抗性(Resistance,R)基因與病原菌無毒(Avirulence,Avr)基因相對應識別時，植物表現(xiàn)出非親和互作的抗性；反之，植物-病原菌缺乏這種基因-基因識別時，寄主表現(xiàn)出感病癥狀。病原菌的致病性和無毒性取決于Avr蛋白的這種兩性分子(bi-functionaleffector)的特征。許多報道表明，抗性寄主利用R基因監(jiān)測TALE至少有3種策略(Schornacketal.,2013)：(1)R基因編碼蛋白作為誘餌陷阱直接與TALE結合，寄主產生過敏反應，如AvrBs3與Bs3之間的識別；(2)突變TALE靶基因需要的通用轉錄因子，阻止轉錄，如水稻中含有xa5隱性基因的抗性機制(Schornacketal.,2006)；(3)突變TALE靶基因的啟動子區(qū)阻止TALE的結合；(4)監(jiān)控TALE基因啟動子區(qū)模仿TALE靶基因的EBE序列，激活監(jiān)控基因，啟動植物抗性。植物監(jiān)控病原菌的效應物主要通過富含核苷酸結合位點的亮氨酸重復區(qū)(NBS-LRR)的蛋白來識別。然而對于TALE的識別機制較少，目前僅有關于番茄中的富含NBS-LRR的Bs4蛋白是通過該機制來識別AvrBs4。由于Bs4蛋白N端含有TIR結構域，還能識別Hax3和Hax4這類的TALE(Kayetal.,2005)。Bs4蛋白識別的具體機制還不清楚，但有研究發(fā)現(xiàn)，在植物體內過量表達AvrBs3也能激發(fā)Bs4蛋白依賴的過敏反應(Schornacketal.,2005)。另一個識別TALE的例子是水稻抗白葉枯病菌Xoo基因xa13，xa13編碼一個蔗糖轉運家族蛋白(SWEET)，其抗性表現(xiàn)在啟動子區(qū)一個小區(qū)域的多態(tài)性，導致TALEPthXo1不能與其啟動子區(qū)結合，進而影響水稻白葉枯病菌Xoo生長所需碳源(Chenetal.,2010)和銅的再分配(Yuanetal.,2010)。水稻Xa27編碼113個氨基酸的蛋白，啟動子區(qū)有TALE結合位點，賦予水稻對具有AvrXa27水稻白葉枯病菌Xoo及非維管束致病菌水稻細菌性條斑病菌Xanthomonasoryzaepv.oryzicola(Xoc)的抗性(Hummeletal.,2012)。最近有報道稱，Xoc中的TALEsTAL6和TAL11a可抑制水稻R基因Xa7對Xoo中TALEAvrXa7的識別，這是首次關于TALEs可作為植物防御反應的抑制子，而缺失C端則無抑制作用，表明TAL6和TAL11a的轉錄激活寄主基因需要抑制作用(Jietal.,2014)。另一個TALE靶標是植物轉錄因子。在Xcv85-10感染辣椒后研究依賴AvrBs3的轉錄譜時發(fā)現(xiàn)超過20個靶基因，命名為UPA(upregulatedbyAvrBs3)。upa20其編碼產物是一個bHLH(basichelix-loop-he-lix)家族的轉錄激活子，該轉錄激活子是AvrBs3誘導的植物細胞過度生長的關鍵調控蛋白。AvrBs3導致葉肉細胞的肥大，在感染后期階段也可能會支持細菌釋放到植物表面(Maroisetal.,2002;Kayetal.,2007)。在柑橘潰瘍病X.citri中也有類似報道，潰瘍是由幾個各異的XcTALEs誘導轉錄因子CsLOB1形成(Huetal.,2014)。Xoc中首次發(fā)現(xiàn)TALETal2g誘導寄主水稻中一個硫酸鹽轉運子(Cernadasetal.,2014)，硫酸鹽是否限制Xoc的生長或是其它機制仍不清楚。該研究還指出，Tal2g誘導多個寄主基因表達，但是對病原菌致病關鍵的基因只有1個直接的S基因，其它被誘導的基因可能是附帶的效應(Cer-nadasetal.,2014)。有趣的是，Xoo和Xoc中的TALEs寄主靶標沒有重合的，Xoo中多個TALEs靶標都是SWEET家族基因，而Xoc中26個TALEs沒有一個靶標是SWEET家族基因(Cernadasetal.,2014)。

3.TAL在植物抗病上的生物工程應用

鑒于以上的植物識別TALEs的機制，及TALE的生物學特性，科學家們開始設計新的植物抗性策略，從各方面擊破病原菌的攻擊，賦予植物新的抗性。TALE通過啟動子模塊識別激活R或者S基因，啟動下游基因，引起非寄主過敏反應或促進病原菌致病。啟動子的模塊易于被基因工程所利用，目的在于使植物獲得新的抗性。

3.1改造抗性R基因監(jiān)控

TALEs富含亮氨酸重復區(qū)的抗性蛋白Bs4能識別多個TALEs，可以通過特異性高表達Bs4等抗性基因，增強植物的抗性。另外，研究表明體外突變抗性基因Rx的LRR區(qū)，會增強植物對效應物的識別特異性(FarnhamandBaulcombe,2006)。利用這一特性，基因工程改造Bs4基因LRR區(qū)可能增強其識別TALE的特異性和親和力。

3.2突變易感S基因的啟動子區(qū)

TALEs通過RVDs識別特定的植物靶基因啟動子區(qū)，水稻抗性基因xa13，其對水稻白葉枯病菌Xoo的抗性表現(xiàn)在啟動子區(qū)一個小區(qū)域的多態(tài)性，導致Xoo中TALEPthXo1不能與xa13啟動子區(qū)結合，進而影響Xoo生長所需碳源(Chenetal.,2010)。利用基因工程將不敏感的基因xa13啟動子區(qū)整合至易感S基因啟動子區(qū)，使植物獲得新抗性。這一方法在易感S基因Os11N3基因上應用成功，獲得了水稻白葉枯病菌Xoo的抗性。另一個例子是，增加一個易感S基因的等位基因，這個等位基因的啟動子區(qū)對于TALEs不敏感(Lietal.,2012)。這一方法需注意：植物中的靶基因無其它未知功能且沒有冗余的拷貝；啟動子區(qū)的改變不能影響看家基因的功能；該靶基因對病原菌的致病性至關重要，最好能抗多個TALEs(Schornacketal.,2013)。S基因的激活對于促進病原菌的致病至關重要，突變S基因的啟動子區(qū)是對大多數(shù)的TALEs比較有效的方法。

3.3增加抗性基因啟動子區(qū)

EBEs陷阱利用抗性基因xa27和Bs3的啟動子區(qū)陷阱，即用生用工程的方法體外合成一個或者多個TALEs結合的EBEs位點至監(jiān)控基因的啟動子區(qū)，使得轉基因植物在病原菌感染過程中注入TALEs時，迅速識別啟動抗性反應。這一方法成功的例子是在Bs3基因上，通過在啟動子區(qū)增加2個EBEs位點，一個是辣椒斑點病致病變種X.euvesicatoria中TALEAvrBs3Δrep16的RVDs部分突變識別區(qū)EBEs位點，另一個是水稻白葉枯病菌Xoo中的TALEAvrX-a27的EBEs位點。結果表明，融合啟動子區(qū)的Bs3表達構建在煙草Nicotianabenthamiana上瞬時表達能夠增強寄主的識別能力(R觟meretal.,2009)。還有在啟動子區(qū)增加6個EBEs的成功報道，通過在Xa27基因上分別增加3個水稻白葉枯病菌Xoo和3個水稻細條病致病變種X.oryzicola中的TALEs的EBEs，轉基因植株具有這2種病原細菌的抗性(Hummeletal.,2012)。

3.4篩選新的監(jiān)控基因

與已知的NBS-LRR抗性基因對比，在不同植物中存在上千個這樣的抗性監(jiān)控基因(Lietal.,2010)。利用深度測序RNA-Seq從辣椒Capsicumpubescens中鑒定并克隆TALEs激活的Bs4C的方法為鑒定更多新的監(jiān)控基因提供了基礎。對于某些情況下，需要減慢或加速過敏反應，可以從調整監(jiān)控基因的數(shù)量或者類型方面進行生物工程改造(Strau覻etal.,2012;Schornacketal.,2013)。目前，有4個R基因被克隆：辣椒CapsicumannuumBs3(R觟meretal.,2007)，辣椒C.pubescensBs4C(Strau覻etal.,2012)，水稻OryzasativaXa10(Tianetal.,2014)和Xa27(Guetal.,2005)。篩選和克隆更多的植物NBS-LRR抗性基因，可以為生物工程改造提供更多的抗性資源。3.5生物工程改造獲得新抗性利用TALEs識別位點和限制性內切酶融合表達，定點改造基因組，將會是成本低廉、特異性識別更強的手段(Schornacketal.,2013)。植物的利用富含NBS-LRR的抗性R基因監(jiān)控病原菌的效應物，監(jiān)控的有效應性依賴于效應物的保守性，對于病原菌越重要的效應物，R基因的識別越容易因該效應物的突變或丟失而失效，開發(fā)更多R基因對于增強和持續(xù)的識別是關鍵。許多植物病毒是DNA單鏈病毒，極少數(shù)是雙鏈的。而單鏈病毒在復制增殖過程中形成DNA雙鏈，利用TALEs特異的DNA雙鏈識別特性，體外合成特異識別的模塊，可用來防治植物病毒病。植物-病原菌互作是一個持續(xù)的進化過程，當病原菌一方通過消除或改變特定的效應物進化避開寄主的監(jiān)控，意味著寄主的R基因系統(tǒng)被打敗。寄主通過R基因互補的改變等才能恢復其抗性。如馬鈴薯NBS-LRRR3a介導識別致病疫霉菌Phytophthorainfestans的AVR3a效應物，AVR3a通過變異逃過R3a的識別(Vleeshouwersetal.,2011)，而R3a被Se-gretin&Kamoun發(fā)現(xiàn)通過單個氨基酸的變異重新恢復識別變異的AVR3a(Schornacketal.,2013)。利用點突變的R基因獲得高抗性的寄主植物。

4.結論

第3篇

積極實踐啟發(fā)式教學，調動學生思維活躍性

在前期精心設計教學內容的基礎上，教學中我們對生物技術中基因工程、細胞工程、發(fā)酵工程、蛋白質工程中的重點知識、原理和操作過程和日常生活中常見的事物聯(lián)系起來，并輔以形象的比喻。這樣做既能把復雜的操作步驟和枯燥、抽象的原理變得形象生動易于學生理解和掌握，同時又能活躍課堂氛圍。例如，在生物遺傳物質DNA重組過程中，DNA分子的切割與連接是最基本的操作，所有這些操作均由一系列功能各異的工具酶來完成。限制性核酸內切酶能夠把大的長的雙鏈DNA分子切割成單個的基因片斷;而DNA連接酶能夠把DN斷重新連接在一起。課堂中我們非常形象地將限制性核酸內切酶稱為“剪刀”，而把DNA連接酶比喻為“縫紉針線”，生物學科學家則是手藝高超的“時裝設計大師”，從而奉獻給世界一個又一個新的DNA分子。這樣就讓學生在輕松愉快的氛圍中理解和掌握了工具酶及其在基因操作中的重要作用。

巧用多媒體和視頻，豐富教學內容

現(xiàn)代生物技術作為一門綜合性學科和前沿技術，涵蓋內容廣，新的生物技術層出不窮，新的科研成果不斷出現(xiàn)。在課堂教學中，除要適時選擇和引入精美的圖片外，還應靈活運用多媒體教學工具，對于一些較為抽象和難理解的教學內容引入相關的FLASH動畫和視頻來加強教學效果。例如，基因工程中利用聚合酶鏈式反應(PCR)獲得目的基因時，只有當PCR反應進行到第三個循環(huán)時才能真正獲得第一個靶基因雙鏈DNA;該反應還涉及聚合酶酶促作用、特異性引物引導以及其他多種反應組成成分。課堂中單純用語言講解較復雜和困難，也很難讓學生徹底理解和掌握。針對這種情況，我們精心制作了相關內容的FLASH，模擬生物體內DNA復制過程，結合PCR反應的三個典型步驟:高溫變性、低溫退火、適溫延伸，生動地演示了脫氧核糖核苷酸按照堿基配對原則在引物引導下和DNA聚合酶酶促作用下以母鏈為模板延伸的過程。該FLASH內容時長8分鐘，引物與模板鏈結合的位置、新鏈延伸的方向和終點等都得以清晰的說明，有效地闡明了PCR體外擴增目的基因的基本原理以及各種組成成分在反應中的作用。FLASH中動畫形象生動、簡潔精彩，極大的加強了教學效果。此外，在講到現(xiàn)代生物技術制藥發(fā)展方向和最新進展時，我們通過搜索現(xiàn)有教學資源，充分利用了近年國家“863”、“973”計劃項目成果展覽會等視頻資料，讓學生們在課堂上對我國生物技術領域前沿的專家學者們的研究課題及研究思路得以接觸和了解，從而搭起書本理論通向現(xiàn)實科研的橋梁。

發(fā)揮互動式教學優(yōu)勢，倡導課堂討論，培養(yǎng)學生主動獲取知識能力

在制藥工程專業(yè)生物技術教學過程中，我們主要采取了課堂提問、預留小問題、及課堂討論等多種互動教學方式。其中，我們尤其注重在教學中組織和開展課堂討論。具體形式為在完成基因工程、細胞工程、發(fā)酵工程、蛋白質/酶工程教學內容后，把學生分成小組(每小組2－4人)，各小組自主選擇主題，利用課外時間到圖書館查閱生物技術制藥方面的專業(yè)著作，或利用網(wǎng)絡資源查閱學術期刊。在此基礎上經(jīng)小組內部討論分析后，整理撰寫成課堂討論書面作業(yè)和制作成多媒體(PPT)課件，并且在課堂上要面向全班同學和老師進行匯報和講解，匯報時間8－10分鐘，之后還有3－5分鐘的討論和質疑階段。為了有效開展課堂討論，通常我們會提前1－2周把課堂討論活動布置和安排下去，以留給學生們充足的時間去查閱資料和準備作業(yè)。在此期間任課教師會對各小組準備中遇到的各類具體問題進行解疑，還會專門在課堂討論進行前的2－3天，逐一檢查各個小組的多媒體制作和完成情況，并就其PPT中存在的問題和不足給予指導和修改。在上述教學活動中，雖然任課教師未親自講課，但為了充分利用好課堂討論這個教學環(huán)節(jié)，不能讓其流于形式，任課教師往往要付出很大的心血和時間去組織和協(xié)助學生。正所謂“功夫不負有心人”，近幾屆的教學實踐表明:這種教學方式一方面能夠有效地提高學生參與教學的積極性，極大地激發(fā)學生對生物技術的好奇心和求知欲;同時，通過課外查閱文獻資料、小組討論、分析問題、整理報告一系列過程也切實培養(yǎng)了學生積極思考、自己動手、歸納問題、總結問題、主動獲取知識的系統(tǒng)能力。教學中課堂氣氛活躍，學生的自學能力、獨立思考問題能力、演講口才和反應能力等方面均得到了鍛煉和提高，因此在教學中適時采用課堂討論的教學方式值得繼續(xù)加強!

結合實踐、強化實驗教學

實驗部分教學是該門課程體系的重要組成部分，是對理論教學的重要補充。在課堂理論教學的基礎上，實驗教學中主要通過強化基礎實驗部分和選擇綜合設計實驗，來培養(yǎng)學生動手能力、實踐能力和創(chuàng)新能力。實驗教學在促進和加強學生對理論教學中的重要原理、方法的理解和掌握方面有著重要作用，但實驗室內完成的多是驗證性實驗，要讓教學和生物制藥實際相結合，還應該讓學生走出實驗室、走出校門，到生物制藥企業(yè)中去親自感受和了解生物技術制藥的發(fā)展現(xiàn)狀。因此，在完成實驗室的實驗教學之外，結合制藥工程專業(yè)總體實踐環(huán)節(jié)，學院通過多方溝通和聯(lián)系，與渭南美邦生物制藥、綠盾生物制藥等幾家公司建立了良好的教學合作關系，讓學生深入廠區(qū)和生產車間去參觀和學習。教學實踐表明:實驗室內設計實驗和校外參觀相結合的教學方式，既能培養(yǎng)學生扎實的基本生物技術操作技能，同時又讓學生充分了解了當前社會生物制藥企業(yè)的規(guī)?；a模式，這對于開闊學生的視野，學生畢業(yè)后的就業(yè)選擇都有極大幫助。

建立有效反饋機制、保障暢通的信息溝通渠道

上述，我們從教學內容和教學方式上進行了探索和改革，并身體力行。但學生對具體教學效果的反響如何，教師真正理解學生期望的教學方式嗎?理解是提高教育質量的有效途徑［3］。在實際教學過程中，許多教師往往因為教學任務重、課時有限，僅限于努力提高自己教學效果，而無意中忽略了去征求或收集學生對這門課的建議和意見。這就不利于授課教師在長期教學生涯中切實有效地改進和提高教學效果。我們在教學過程中，嘗試并建立了以下溝通渠道:①教學伊始就將授課教師的具體聯(lián)系方式(包括電子郵箱信息)提供給全班同學，鼓勵大家在課內或課外就遇到的問題和老師積極溝通和交流;②每一大節(jié)課第二小節(jié)課的最后5－10分鐘留給學生，便于部分學生就某具體問題和老師進行交流和討論;③完成全書主要章節(jié)教學內容一半及授課即將結束時，由學生以匿名的形式對教學環(huán)節(jié)中不足之處或值得發(fā)揚的地方寫出書面意見和建議，由班干部于課后統(tǒng)一收齊后交給任課老師，便于教師進一步改進該門課程的教學。通過以上教學實踐表明:學生在教學中的主體地位和意識得到明顯加強，學生感覺到自己的意見和建議得到及時響應，因而參與教學的積極性也大大加強。由于及時采納了學生的建議，老師和同學建立了良好的互信關系，該門課程也取得了良好的教學效果，同時還提升了學生對制藥工程專業(yè)整體的滿意度。