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摘要：長期以來，因抗生素和重金屬藥物的過度使用，致使微生物產(chǎn)生耐藥性，耐藥細(xì)菌的蔓延已成為全人類的重大公共衛(wèi)生安全議題。人們對微生物的抗生素抗性、重金屬抗性進(jìn)行了大量研究。綜述了目前微生物抗生素抗性、重金屬抗性以及抗生素與重金屬協(xié)同抗性方面的研究進(jìn)展，重點(diǎn)論述了微生物重金屬抗性的分子機(jī)制。結(jié)合課題組相關(guān)研究進(jìn)展對未來研究進(jìn)行了展望，以期為現(xiàn)有抗性微生物所致危害的減輕和未來抗性相關(guān)研究的深入提供參考。

關(guān)鍵詞：抗生素；重金屬；抗性；抗生素抗性基因；共選擇

引言

隨著人們生活水平的日益提高，環(huán)境問題逐漸成為人們關(guān)注的焦點(diǎn)，因藥物濫用引起的微生物耐藥性越來越受到人們的關(guān)注。抗生素是目前使用量最多、應(yīng)用面最廣泛的藥物，被使用的抗生素，高達(dá)75％被人體和動物排出，最終進(jìn)入環(huán)境。環(huán)境中抗生素的殘留，使一些微生物產(chǎn)生耐藥性，甚至引發(fā)了超級細(xì)菌的產(chǎn)生，如MRSA，VRE，E.coliNDM-1等，它們能抵抗多種抗生素，E.coliNDM-1甚至是無藥可醫(yī)[1]。除抗生素外，一些金屬離子也被廣泛應(yīng)用于醫(yī)藥和其他領(lǐng)域中，如Ag，Sb，Bi等金屬化合物用于感染、寄生蟲、潰瘍等治療[2]，Cu，Zn，Cd，As等金屬化合物用作生長促進(jìn)劑、殺菌劑、除草劑和抗菌劑等[3]。金屬元素 的開發(fā)與利用導(dǎo)致環(huán)境中出現(xiàn)了重金屬累積，因化學(xué)性質(zhì)穩(wěn)定，在環(huán)境中不易降解，更易使微生物產(chǎn)生抗性。抗生素和抗菌金屬的復(fù)合作用致使一些微生物出現(xiàn)了雙重抗性，如魚、蝦體內(nèi)及沉積物中分離的氣單胞菌屬(Aeromonasspp.)[4]，醫(yī)院分離的傷寒沙門菌(SalmonellaentericaserovarTyphimurium)[5]、洋蔥伯克氏菌(Burkholderiacepacia)[6]等，給環(huán)境和人類健康帶來了巨大的威脅。基因型決定著表型，因抗性基因可在不同細(xì)菌間轉(zhuǎn)移、傳播和自我擴(kuò)增的生物學(xué)特性，給人類健康帶來了巨大的潛在威脅[7]。綜合已有研究，結(jié)合抗生素與重金屬抗性研究進(jìn)展，本文重點(diǎn)對微生物金屬抗性的分子機(jī)制進(jìn)行論述，以期為有效減緩微生物耐藥性的發(fā)展及抗性元件在環(huán)境中的擴(kuò)散作出貢獻(xiàn)。

1.微生物抗生素抗性的研究進(jìn)展

自1937年第一批磺胺類藥物問世以來，即出現(xiàn)了磺胺抗性的相關(guān)報道，隨后陸續(xù)發(fā)現(xiàn)多種抗性細(xì)菌[8]。總結(jié)2000年之前一百多年間幾個不同時期微生物的耐藥性，發(fā)現(xiàn)隨著抗生素的使用，微生物的耐藥種類、耐藥率呈現(xiàn)出顯著遞增的趨勢[9]。近年來新型抗生素的發(fā)現(xiàn)和開發(fā)速度持續(xù)下降，而抗生素抗性基因(AntibioticResistanceGenes，ARGs)卻快速出現(xiàn)和擴(kuò)散，如英國某奶牛場的126株大腸桿菌中存在著blaCTX-M，blaTEM和blaOXA基因，控制著超廣譜β-內(nèi)酰胺酶（ESBL）的產(chǎn)生[10]；巴西南部農(nóng)場的135株大腸桿菌中，檢測到了基因blaCMY-M2、blaTEM-1和qnrS存在[11]；2016年來自中國動物的大腸桿菌（EscherichiacoliSHP45）mcr-1基因的報道[12]，預(yù)示著最后一道抗生素防線多粘菌素將失去作用。ARGs的出現(xiàn)和擴(kuò)散極大地影響了抗生素的治療效果，威脅著人類的健康，質(zhì)粒、整合子、轉(zhuǎn)座子這些抗性基因的主要攜帶者加速了抗性基因在不同微生物間轉(zhuǎn)移和傳播，質(zhì)粒的自我轉(zhuǎn)移性、int1和int2整合子中耐藥基因盒的存在使它們成為了抗性基因的主要傳遞者[13]。

2.微生物重金屬抗性的研究進(jìn)展

自1960年人類從外傷病人的傷口分離出抗Hg金黃色葡萄球菌[14]以來，人類就開始了對微生物金屬抗性機(jī)制的研究。到目前為止，人們有關(guān)微生物的Hg，Cu，Ag，As，Zn等金屬的抗性機(jī)制進(jìn)行了大量的研究。對耐Hg細(xì)菌研究表明，微生物可將Hg2+轉(zhuǎn)化成不溶性的Hg，其在室溫下可作為蒸氣從細(xì)菌細(xì)胞中揮發(fā)出來[15]。據(jù)DAS等[16]所述，窄譜mer操縱子和廣譜mer操縱子調(diào)控著耐Hg細(xì)菌對Hg的揮發(fā)。窄譜mer操縱子賦予細(xì)菌對無機(jī)Hg的抗性，Hg2+與細(xì)菌細(xì)胞周質(zhì)空間的MerP結(jié)合，MerP將其轉(zhuǎn)運(yùn)至質(zhì)膜的MerT上，MerT上的Hg2+通過與跨膜螺旋上的半胱氨酸結(jié)合而進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)，在細(xì)胞內(nèi)被merA編碼的Hg還原酶還原為Hg0，MerR調(diào)控Hg抗性結(jié)構(gòu)基因的表達(dá)，MerD起到二次調(diào)節(jié)的作用。另一個位于merA基因上游的Hg2+轉(zhuǎn)運(yùn)體merH，通過與半胱氨酸殘基結(jié)合轉(zhuǎn)運(yùn)Hg2+并能與merA本身共表達(dá)。廣譜mer操縱子除包含與窄譜操縱子相似的基因外，還存在其他基因，如merB基因編碼的有機(jī)Hg（R-Hg）裂解酶裂解C-Hg鍵，Hg2+被還原為Hg0。近年來的研究發(fā)現(xiàn)merB基因僅存在于少數(shù)的耐Hg細(xì)菌中[17-18]，表明R-Hg對大多數(shù)細(xì)菌仍存在著抑制、殺傷作用。細(xì)菌細(xì)胞具有控制正常Cu含量的系統(tǒng)，以抵抗高水平的Cu對其帶來的毒害作用。據(jù)HOBMAN等[19]所述，4個系統(tǒng)維持著腸桿菌科細(xì)菌的Cu穩(wěn)態(tài)，即cus，cue，pco和cop。Cus系統(tǒng)中基因cusR和cusS調(diào)節(jié)基因簇cusCFBA的表達(dá)，表達(dá)后的CusCFBA蛋白質(zhì)控制細(xì)胞內(nèi)Cu2+的流出與細(xì)胞外H+的流入，但該系統(tǒng)僅在好氧條件下賦予細(xì)菌在中低等Cu水平的抗性。Cue，cop系統(tǒng)是調(diào)節(jié)大腸桿菌Cu抗性的主要機(jī)制，系統(tǒng)中cueO基因編碼氧化Cu+的多Cu氧化酶將Cu+氧化為毒性較小的Cu2+，再通過copA基因編碼的P型ATP酶驅(qū)動Cu外排系統(tǒng)將細(xì)胞質(zhì)中的Cu排出細(xì)胞。Pco系統(tǒng)中含有多個pco基因簇，作為補(bǔ)充為大腸桿菌提供進(jìn)一步的Cu抗性。除上述提到的一些銅抗性基因，細(xì)菌中還存在著copB，copC，copD，cueR，cutC，cutF等基因[20]，賦予其Cu抗性。NEUBERT等[20]發(fā)現(xiàn)銅分子伴侶CupA可促進(jìn)Cu2+還原成Cu1+，進(jìn)而促進(jìn)銅的減少。Ag抗性由細(xì)菌中的sil基因座（silPGABFCRSE）賦予，基因座中的3個轉(zhuǎn)錄單位（silCFBAGP，silRS，silE）由不同的啟動子表達(dá)并相互作用，形成ATPase外排泵，將Ag+泵出細(xì)胞外，從而賦予細(xì)菌Ag抗性[21]。通過序列分析與定點(diǎn)誘變發(fā)現(xiàn)SilE上含組氨酸與甲硫氨酸的基序可促進(jìn)SilE與Ag+的結(jié)合，使SilE類似于一個吸收Ag+的“分子海綿”[22]。SAEB等[20]發(fā)現(xiàn)一些細(xì)菌中oprB，oprM和cusC_1基因編碼的CusC蛋白所決定的外排泵系統(tǒng)可同時賦予細(xì)菌Cu/Ag抗性。As抗性一般由ars操縱子調(diào)控，arsC編碼的As還原酶還原As5+為As3+，隨后arsB編碼的亞As酸鹽逆向轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白ArsB或ArsAB將As3+排出；一些細(xì)菌還可通過arsM編碼的甲基轉(zhuǎn)移酶ArsM使甲基從S-腺苷甲硫氨酸轉(zhuǎn)移至As3+，隨后被揮發(fā)或被甲基As酸鹽轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白ArsP排出；某些細(xì)菌體內(nèi)還存在著gapdh和arsJ組成的雙基因系統(tǒng)，通過gapdh調(diào)控的生化反應(yīng)和ArsJ的外排作用賦予對V價R-As的抗性[23]。Zn抗性被認(rèn)為是由Zn進(jìn)入和Zn外排泵的組合系統(tǒng)控制，如ZntA，ZntB等[24]。LU等[25]研究發(fā)現(xiàn)ZntA不僅參與細(xì)菌的Zn穩(wěn)態(tài)，還能傳輸非生理性底物Cd和Pb，還發(fā)現(xiàn)存在于苜蓿中華根瘤菌（SinorhizobiummelilotiCCNWSX0020）中編碼Cu+/Ag+轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的一個基因copA1b，對Cu抗性沒有任何貢獻(xiàn)，卻有助于Zn，Cd和Pb的耐受性。Cd，Cr，Pb，Ni等金屬相對來說使用量較少，微生物相關(guān)的抗性機(jī)制研究也相對較少，據(jù)DAS等所述[16]，也是由相關(guān)的操縱子與基因賦予。如Cd抗性由質(zhì)粒攜帶的cad操縱子和czc操縱子調(diào)控，Pb抗性由pbr操縱子賦予，Cr抗性由chrA基因編碼的Cr酸鹽外排蛋白控制，Ni抗性由cnrYHXCBAT基因系統(tǒng)編碼的cnrCBA外排泵介導(dǎo)。CABRAL等[26]對巴西紅樹林沉積物中的微生物群落進(jìn)行宏基因組與轉(zhuǎn)錄組分析時，鑒定出編碼Zn，Cd，Co抗性蛋白的基因czcR，czcD，czcB，czcC和czcA以及陽離子外排系統(tǒng)蛋白cusA基因。由上可見，人們對微生物金屬抗性機(jī)制的研究已經(jīng)取得了很大進(jìn)步，但仍需進(jìn)一步探究與微生物金屬抗性相關(guān)的基因以及機(jī)制，以期從分子角度為醫(yī)學(xué)及環(huán)境污染問題提供解決方案。

3.微生物抗生素抗性與重金屬抗性的協(xié)同選擇研究進(jìn)展

人們最初研究微生物對金屬Hg的抗性時，發(fā)現(xiàn)含有質(zhì)粒R100的微生物具有Hg抗性的同時，還對鏈霉素、四環(huán)素、磺胺和氯霉素有抗性[27]。隨后人們陸續(xù)發(fā)現(xiàn)一些大腸桿菌具有類似的抗性[28]。如今越來越多的具有重金屬和抗生素協(xié)同抗性的細(xì)菌被篩選出來[4-6]。根據(jù)研究者對現(xiàn)有抗性機(jī)制的解析結(jié)果，協(xié)同抗性、交叉抵制、協(xié)同調(diào)控和生物膜的誘導(dǎo)4類機(jī)制控制著微生物的多重耐藥性[29]。近年來，人們還發(fā)現(xiàn)在重金屬殘留地區(qū)，ARGs的水平會隨著重金屬污染水平的增加而增加。如GAO等[30]研究環(huán)境中殘留的抗生素和重金屬對城市污水中紅霉素抗性基因（ERY-ARGs）的影響時，發(fā)現(xiàn)ere（A），ere（B），erm（B）等ERY-ARGs豐度與Zn殘留水平呈現(xiàn)出顯著的正相關(guān)；ZHOU等[31]在研究重金屬的選擇對ARGs的流行與傳播時，發(fā)現(xiàn)ARGs的數(shù)量與重金屬的總濃度具有正相關(guān)性；ZHANG等[32]研究垃圾滲濾液處理廠及周圍土壤和地表水中ARGs發(fā)生時，發(fā)現(xiàn)sul2基因與Zn，Cr呈顯著的正相關(guān)，同時還發(fā)現(xiàn)int1的豐度與金屬Zn，Ni，Cr也具有顯著的正相關(guān)性。現(xiàn)階段仍需進(jìn)一步探究重金屬水平對ARGs豐度的影響，以評估ARGs對環(huán)境和人類可能帶來的威脅。

4.微生物抗性的未來研究展望

微生物的抗生素抗性、重金屬抗性以及抗生素與重金屬的協(xié)同抗性已經(jīng)成為了威脅人類、動植物和環(huán)境的全球性問題。醫(yī)藥、農(nóng)業(yè)、畜牧業(yè)領(lǐng)域中抗生素與重金屬藥物的合理使用，環(huán)境中抗生素與重金屬的殘留累積是目前環(huán)境治理的重中之重，它不是某個組織、某個國家的問題，應(yīng)是全人類為之奮斗并解決的問題。本課題組于近期對某城市污水河道中的大腸桿菌抗生素耐藥性進(jìn)行了分析，結(jié)果顯示檢測的17種抗生素中，69.1%的分離株對其中的1~13種抗生素具有抗性（結(jié)果另文發(fā)表）。與2013，2014年對該流域的大腸桿菌抗生素抗性檢測結(jié)果[33]比較，顯示目前的大腸桿菌對11種抗生素抗性呈現(xiàn)大幅度的下降，表明抗生素的減量使用及污水河道治理對微生物的耐藥性存在著顯著的消減作用。盡管已有大量研究報道了金屬壓力可以增加微生物的抗生素抗性，但其中僅少數(shù)研究確定了一些重金屬的濃度水平與某些抗生素抗性的關(guān)聯(lián)，本課題組檢測了上述污水河道大腸桿菌對Cu，Hg，Ag，Zn這4種重金屬的抗性，結(jié)果顯示大多數(shù)的分離菌株對4種重金屬無抗性，僅少數(shù)的分離菌株對Ag和Hg呈現(xiàn)出較弱程度的抗性（結(jié)果另文發(fā)表），抗生素和金屬表型數(shù)據(jù)未呈現(xiàn)顯著關(guān)聯(lián)。到目前為止大多數(shù)的研究仍缺乏金屬抗性與抗生素抗性表型及基因型對應(yīng)關(guān)系的數(shù)據(jù)，這方面研究亟待加強(qiáng)。同時需進(jìn)一步研究和了解水平遺傳元件（質(zhì)粒、整合子和轉(zhuǎn)座子）的性質(zhì)，進(jìn)一步開展環(huán)境中抗性基因和多重抗性污染水平的研究，為更加有效地遏制抗性基因在環(huán)境中的擴(kuò)散，評估復(fù)合污染和多重抗性帶來的生態(tài)風(fēng)險與公共健康威脅提供理論依據(jù)。

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作者：王小壘 李鳳姿 何家樂 劉言 楊洪巖 單位：東北林業(yè)大學(xué)