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《中成藥雜志》2015年第六期

1材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)藥物水溶性蜂膠(含14.7%總黃酮，廣州市杰禾蜂業(yè)有限公司，批號(hào)20121103-A)，按蜂膠總黃酮量200mg/kg對(duì)大鼠給藥;完全弗氏佐劑(美國Sigma公司);納洛酮(Naloxone)注射液(北京四環(huán)制藥廠，批號(hào)20110106);阿司匹林腸溶片(南京白敬字制藥有限責(zé)任公司，批號(hào)121207)，按100mg/kg對(duì)大鼠給藥［9］;非選擇性一氧化氮合酶抑制劑N-硝基-L-精氨酸甲酯(L-NAME，美國Sigma公司)。

1.2主要儀器與試劑PL-200熱刺痛儀(成都泰盟科技有限公司);BW-YLS-3E電子壓痛儀、YLS-7B足跖容積測(cè)量?jī)x(上海軟隆科技發(fā)展有限公司);UV-3200PCS紫外可見分光光度計(jì)(上海美譜達(dá)儀器有限公司);Model-680型酶標(biāo)儀(美國BIO-RAD公司);BeckmanCoulter微量臺(tái)式離心機(jī)(美國Beckman公司)。NO試劑盒(南京建成生物工程研究所);PLA2、PGE2、TNF-α、IL-6試劑盒(合肥博美生物科技有限公司);其余試劑均為分析純(國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司)。

1.3實(shí)驗(yàn)動(dòng)物清潔級(jí)雄性SD大鼠48只，體質(zhì)量(200±20)g，由合肥蜀山實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物合格證號(hào):SCXK(蘇)2009-0001，籠養(yǎng)3～4d后進(jìn)行行為學(xué)測(cè)試和實(shí)驗(yàn)，12h～12h明暗周期，室溫20～22℃。動(dòng)物適應(yīng)性喂養(yǎng)一周。

1.4試驗(yàn)方法

1.4.1實(shí)驗(yàn)分組雄性SD大鼠42只，隨機(jī)分為7組(n=6):正常對(duì)照組(NC組)、炎性痛模型組(CFA組)、炎性痛+水溶性蜂膠組(CFA+WSP組)、炎性痛+阿司匹林組(CFA+P組)、炎性痛+水溶性蜂膠+阿司匹林組(CFA+WSP+P組)、炎性痛+水溶性蜂膠+納洛酮組(CFA+WSP+NAL組)和炎性痛+水溶性蜂膠+非選擇性一氧化氮合酶抑制劑組(CFA+WSP+L-NAME組)。

1.4.2慢性炎性疼痛模型的建立炎性痛模型組(CFA組)，消毒大鼠左側(cè)后肢，用1mL注射器抽取150μL弗氏完全佐劑(Completefreund’sadju-vant，CFA內(nèi)含0.1%滅活結(jié)核桿菌;Sigma)，于左側(cè)后肢足底皮下注射，注射后按壓數(shù)分鐘，以促進(jìn)藥物擴(kuò)散。正常對(duì)照組(NC組)足底皮下注射150μL生理鹽水，其余操作同炎性痛模型組。

1.4.3水溶性蜂膠在炎性痛模型中的鎮(zhèn)痛作用測(cè)定各組大鼠基礎(chǔ)痛閾值，每日相同時(shí)間點(diǎn)分別給予炎性痛+水溶性蜂膠組、炎性痛+水溶性蜂膠+納洛酮組及炎性痛+水溶性蜂膠+非選擇性一氧化氮合酶抑制劑組大鼠灌胃WSP(蜂膠總黃酮量200mg/kg)，炎性痛+阿司匹林組(大鼠灌胃1mL阿司匹林(100mg/kg)，炎性痛+水溶性蜂膠+阿司匹林組大鼠灌胃WSP(蜂膠總黃酮量200mg/kg)和阿司匹林水溶液(100mg/kg)1mL，NC組和炎性痛模型組大鼠灌胃等容積的生理鹽水，連續(xù)用藥14d;大鼠于炎性痛模型第7天，每日相同時(shí)間點(diǎn)，腹腔注射(ip)納洛酮(4mg/kg)為炎性痛+水溶性蜂膠+納洛酮組;腹腔注射(ip)L-NAME(100μg/kg)為炎性痛+水溶性蜂膠+非選擇性一氧化氮合酶抑制劑組，NC組和炎性痛模型組大鼠腹腔注射等體積的生理鹽水為對(duì)照，連續(xù)給藥7d;其他操作同炎性痛+水溶性蜂膠組，給藥1.5h后，分別用PL-200熱刺痛儀和BW-YLS-3E電子壓痛儀測(cè)定各組大鼠的熱痛閾潛伏期和機(jī)械痛閾值。

1.5行為學(xué)測(cè)定

1.5.1一般情況測(cè)定觀察動(dòng)物每天左后肢變化，如有無紅腫，注射部位有無滲液感染等，進(jìn)食有無影響;觀察步態(tài)姿勢(shì)，有無舔咬現(xiàn)象及肢體癱瘓功能障礙，每日測(cè)定大鼠體質(zhì)量。

1.5.2足跖容積測(cè)定在每天相同時(shí)間點(diǎn)，用YLS-7B足跖容積測(cè)量?jī)x分別測(cè)定正常對(duì)照組及炎性痛模型組大鼠的左側(cè)足跖的容積。

1.5.3熱刺痛法測(cè)試前讓大鼠在較黑暗的環(huán)境中適應(yīng)約5min，待大鼠安靜后，移動(dòng)熱輻射光源，使其通過透明玻璃板聚焦于大鼠左后趾足底部皮膚，觀察大鼠對(duì)熱傷害性刺激的反應(yīng)。當(dāng)大鼠出現(xiàn)抬足、舔腳反應(yīng)時(shí)的時(shí)間為熱痛閾潛伏期(Ther-malwithdrawallatency，TWL)。當(dāng)時(shí)間達(dá)到30s，而大鼠仍無反應(yīng)時(shí)便停止照射，以免損傷皮膚，并以30s作為最高痛閾。每日于給藥后30min測(cè)定痛閾，測(cè)定時(shí)每組循環(huán)測(cè)定3次，兩次時(shí)間間隔大于5min，取3次測(cè)定值的均數(shù)作為大鼠的熱痛閾潛伏期。

1.5.4機(jī)械壓痛法在室溫、安靜狀態(tài)下，將大鼠左側(cè)后肢足背部置于壓痛儀硅板上，腳踩踏板增加壓爪強(qiáng)度，當(dāng)大鼠出現(xiàn)縮腿、掙扎、嘶叫時(shí)，踩下踏板，此時(shí)壓強(qiáng)為機(jī)械壓痛閾值(Mechanicalwithdrawalthreshold，MWT)。當(dāng)機(jī)械壓痛質(zhì)量達(dá)到250g，而大鼠仍無反應(yīng)時(shí)便停止壓爪，以免損傷皮膚，并以250g作為最高痛閾。痛閾測(cè)定時(shí)每組循環(huán)測(cè)定3次，2次時(shí)間間隔大于5min，取3次測(cè)定值的均數(shù)作為大鼠的機(jī)械壓痛閾值。

1.6生化檢測(cè)及形態(tài)學(xué)觀察

1.6.1大鼠血清中IL-6、TNF-α及NO水平的測(cè)定于制備炎性痛模型第14天，大鼠頸總動(dòng)脈取血3～5mL，分離血清，測(cè)定其中IL-6、TNF-α及NO水平。

1.6.2大鼠致炎足關(guān)節(jié)滲出液中PGE2和PLA2水平的測(cè)定于制備炎性痛模型第14天，將大鼠處死，在致炎足踝關(guān)節(jié)上方0.5cm處剪取后足腫脹足爪，縱向切開，放入5mL生理鹽水的試管中，4℃浸泡過夜，以3000r/min離心10min，取上清液，嚴(yán)格按照試劑盒說明書采用酶聯(lián)免疫吸附法檢測(cè)其中PGE2和PLA2的量。

1.6.3大鼠致炎足及肝臟的形態(tài)學(xué)觀察留取各組大鼠致炎足及肝臟于10%福爾馬林溶液中浸泡，進(jìn)行HE染色觀察其形態(tài)學(xué)變化。

1.7數(shù)據(jù)處理及分析分別以引起機(jī)械痛閾的質(zhì)量數(shù)值(g)、熱痛閾的照射時(shí)間(s)來表示機(jī)械痛閾和熱痛閾。采用SPSS16.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(x±s)表示，多組均數(shù)比較用單因素方差分析(OnewayANOVA)，兩兩比較用S-N-K法，以P＜0.05表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。采用GraphPadPrism5軟件作圖。

2結(jié)果

2.1足跖容積測(cè)定炎性痛模型組大鼠左足跖皮下注射完全弗氏佐劑后開始腫脹，足跖容積與正常對(duì)照組相比顯著升高(P＜0.01)，直至造模后第14天足跖容積仍高于正常對(duì)照組(P＜0.01)。結(jié)果表明炎性痛模型構(gòu)建成功。

2.2各組大鼠機(jī)械痛閾值與正常對(duì)照組相比，炎性痛模型組大鼠注射完全弗氏佐劑后第1天開始機(jī)械痛閾值明顯下降，持續(xù)14d仍存在(P＜0.01)，提示炎性痛模型大鼠存在機(jī)械痛覺過敏;同炎性痛模型組相比，炎性痛+水溶性蜂膠組、炎性痛+阿司匹林組和炎性痛+水溶性蜂膠+阿司林組大鼠在灌胃給藥第2天后機(jī)械痛閾值出現(xiàn)增高，直到造模后第14天差異仍舊存在，差異有顯著性(P＜0.05)。如圖3所見，給各組大鼠腹腔注射用藥前，與正常對(duì)照組相比，炎性痛模型組、炎性痛+水溶性蜂膠組、炎性痛+水溶性蜂膠+納洛酮組和炎性痛+水溶性蜂膠+非選擇性一氧化氮合酶抑制劑組大鼠機(jī)械痛閾值明顯低于正常對(duì)照組(P＜0.05)，與炎性痛模型組相比，炎性痛+水溶性蜂膠組大鼠機(jī)械痛閾值明顯增高(P＜0.01);腹腔注射阿片受體阻斷劑納絡(luò)酮(NAL)后，炎性痛+水溶性蜂膠+納洛酮組大鼠機(jī)械痛閾值增高程度被部分阻斷，同炎性痛+水溶性蜂膠組相比，差異有顯著性，表明腹腔注射阿片受體阻斷劑納絡(luò)酮能部分阻斷WSP對(duì)炎性痛大鼠的鎮(zhèn)痛作用;腹腔注射非選擇性一氧化氮合酶抑制劑L-NAME后，炎性痛+水溶性蜂膠+非選擇性一氧化氮合酶抑制劑組大鼠機(jī)械痛閾值明顯高于炎性痛+水溶性蜂膠組，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)，表明腹腔注射非選擇性一氧化氮合酶抑制劑L-NAME后，通過減少炎性痛大鼠外周組織NO的生成，從而增強(qiáng)了WSP的抗炎鎮(zhèn)痛效應(yīng)。見圖3。

2.3各組大鼠熱痛閾值與正常對(duì)照組相比，炎性痛模型組大鼠注射弗氏完全佐劑后第1天開始熱痛閾值明顯下降，持續(xù)14d仍存在(P＜0.01)，提示炎性痛模型大鼠存在熱痛覺過敏;同炎性痛模型組相比，炎性痛+水溶性蜂膠組、炎性痛+阿司匹林組和炎性痛+水溶性蜂膠+阿司匹林組大鼠在灌胃給藥第2天后熱痛閾值亦明顯增高，直到造模后第14天差異仍舊存在，有顯著性差異(P＜0.05)。給各組大鼠腹腔注射用藥前，與正常對(duì)照組相比，炎性痛模型組、炎性痛+水溶性蜂組、炎性痛+水溶性蜂膠+納洛酮組和炎性痛+水溶性膠+非選擇性一氧化氮合酶抑制劑組大鼠熱痛閾值明顯低于正常對(duì)照組(P＜0.05)，與炎性痛模型組相比，炎性痛+水溶性蜂膠組大鼠熱痛閾值明顯明顯增高(P＜0.01);腹腔注射阿片受體阻斷劑納絡(luò)酮(NAL)后，炎性痛+水溶性蜂膠+納洛酮組大鼠熱痛閾值增高程度被部分阻斷，同炎性痛+水溶性蜂膠組相比，差異有顯著性，表明腹腔注射阿片受體阻斷劑納絡(luò)酮能部分阻斷WSP對(duì)炎性痛大鼠的鎮(zhèn)痛作用;腹腔注射非選擇性一氧化氮合酶抑制劑L-NAME后，炎性痛+水溶性蜂膠+非選擇性一氧化氮合酶抑制劑組大鼠熱痛閾值明顯高于炎性痛+水溶性蜂膠組，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)，表明腹腔注射非選擇性一氧化氮合酶抑制劑L-NAME后，通過減少炎性痛大鼠外周組織NO的生成，從而增強(qiáng)了WSP的抗炎鎮(zhèn)痛效應(yīng)。

2.4水溶性蜂膠聯(lián)合阿司匹林對(duì)炎性痛大鼠血清中IL-6、TNF-α及NO水平的影響與正常對(duì)照組相比，炎性痛模型組大鼠血清中IL-6、TNF-α及NO水平明顯增高(P＜0.01);同炎性痛模型組相比，炎性痛+水溶性蜂膠組，炎性痛+阿司匹林組和炎性痛+水溶性蜂膠+阿司匹林組大鼠血清中IL-6、TNF-α及NO水平均顯著降低(P＜0.05);同炎性痛+水溶性蜂膠組和炎性痛+阿司匹林組相比，炎性痛+水溶性蜂膠+阿司匹林組大鼠血清中IL-6、TNF-α及NO水平也有明顯降低(P＜0.05)，說明WSP通過抑制炎性痛大鼠外周組織炎性因子的釋放而發(fā)揮鎮(zhèn)痛效應(yīng)，與阿司匹林(P)聯(lián)合使用其作用增強(qiáng)，具有協(xié)同效應(yīng)。

2.5水溶性蜂膠聯(lián)合阿司匹林對(duì)大鼠致炎足關(guān)節(jié)滲出液中PLA2和PGE2水平的影響與正常對(duì)照組相比，炎性痛模型組大鼠致炎足關(guān)節(jié)滲出液中PLA2和PGE2水平明顯增高(P＜0.01);同炎性痛模型組相比，炎性痛+水溶性蜂膠組、炎性痛+阿司匹林組和炎性痛+水溶性蜂膠+阿司匹林組大鼠患足關(guān)節(jié)滲出液中PLA2和PGE2水平均降低(P＜0.05);同炎性痛+水溶性蜂膠組和炎性痛+阿司匹林組相比，炎性痛+水溶性蜂膠+阿司匹林組大鼠致炎足關(guān)節(jié)滲出液中PLA2和PGE2含量明顯降低(P＜0.05)。結(jié)果表明WSP具有抑制炎性痛大鼠炎性部位PLA2和PGE2的釋放而發(fā)揮鎮(zhèn)痛效應(yīng)，與阿司匹林(P)聯(lián)合使用其作用增強(qiáng)，具有協(xié)同效應(yīng)。

2.6HE染色

2.6.1大鼠足跖部病理變化的組間比較正常對(duì)照組大鼠左側(cè)足皮下組織結(jié)構(gòu)清晰整齊，無炎性細(xì)胞浸潤;炎性痛模型組大鼠致炎足皮下結(jié)締組織排列紊亂，大量炎癥細(xì)胞浸潤，水腫明顯;炎性痛+水溶性蜂膠組和炎性痛+阿司匹林組大鼠致炎足皮下組織輕微水腫，炎性細(xì)胞浸潤減少;炎性痛+水溶性蜂膠+阿司匹林組大鼠致炎足皮下組織排列整齊，無明顯水腫，炎性細(xì)胞浸潤減少(見圖6)。

2.6.2各組大鼠肝臟病理變化正常對(duì)照組大鼠肝細(xì)胞為多邊形，界限較清楚，細(xì)胞體積較大，核仁清楚，肝血竇內(nèi)可見散在巨噬細(xì)胞;炎性痛模型組大鼠肝細(xì)胞水腫，肝血竇內(nèi)大量炎性細(xì)胞浸潤;炎性痛+水溶性蜂膠組和炎性痛+阿司匹林組大鼠肝血竇內(nèi)一定量炎性細(xì)胞浸潤;炎性痛+水溶性蜂膠+阿司匹林組大鼠肝血竇內(nèi)少量炎性細(xì)胞浸潤(見圖7)。

3討論

炎癥是機(jī)體在有害刺激作用下，多種因素導(dǎo)致局部組織細(xì)胞損傷的病理過程，也是機(jī)體對(duì)抗損傷的防御性保護(hù)反應(yīng)。在致炎因素刺激下，細(xì)胞膜磷脂酶A2(PLA2)被激活，水解膜磷脂的酯鍵，釋放出花生四烯酸，經(jīng)環(huán)氧合酶作用產(chǎn)生前列腺素，前列腺素E2(PGE2)是其中主要組分，PGE2具有強(qiáng)烈的擴(kuò)血管作用，從而引起炎癥部位組織水腫，炎性滲出，同時(shí)還具有致敏痛覺神經(jīng)末梢，造成痛覺過敏;多種炎癥介質(zhì)和細(xì)胞因子調(diào)控炎癥反應(yīng)過程，其中一氧化氮(NO)在炎癥反應(yīng)的許多環(huán)節(jié)中發(fā)揮復(fù)雜的調(diào)節(jié)作用，如在細(xì)胞間信息傳遞過程中起信使作用，促炎作用包括舒血管作用，引起炎癥部位組織水腫，增加炎性滲出等;TNF-α是一具有重要生物學(xué)功能的細(xì)胞因子，能激活血管內(nèi)皮功能，增加白細(xì)胞黏附，激活凝血系統(tǒng)，抑制纖溶，激活單核-巨噬細(xì)胞釋放IL-6和PGE2等炎癥介質(zhì)等多途徑發(fā)揮其致炎作用。

疼痛是炎癥的主要癥狀，國際上已經(jīng)將疼痛列為第五生命體征。疼痛的評(píng)定主要有痛閾的測(cè)定、疼痛的主體評(píng)測(cè)和客體評(píng)測(cè)等［12］。慢性炎性疼痛對(duì)患者的工作和生活影響較大，現(xiàn)有臨床各類抗炎藥雖有一定療效，但均因同時(shí)具有不同程度的副作用而限制了其對(duì)疼痛的有效治療，深入探討炎性疼痛產(chǎn)生的機(jī)制，尋求更為有效的治療方法亟待解決。阿司匹林(P)又稱乙酰水楊酸，屬于非甾體抗炎藥，其通過抑制環(huán)氧合酶的活性，使前列腺素等炎癥介質(zhì)生成減少，從而實(shí)現(xiàn)其抗炎鎮(zhèn)痛作用，由于其本身具有酸性，造成胃腸道的不良反應(yīng)，限制了其在臨床上的廣泛應(yīng)用。蜂膠有“紫色黃金”的美譽(yù)［2］，具有多種藥理作用，如抗炎鎮(zhèn)痛和心血管藥理作用等，對(duì)蜂膠的抗炎鎮(zhèn)痛作用有諸多報(bào)道，對(duì)其抗炎機(jī)制研究也取得了一定的進(jìn)展，但對(duì)于蜂膠抗炎活性研究的藥物開發(fā)卻不盡人意，尤其是在蜂膠與抗炎藥物的相互作用研究較少，對(duì)于蜂膠與非甾體抗炎藥的相互作用尚未見報(bào)道。

本實(shí)驗(yàn)通過建立炎性痛致炎性疼痛大鼠模型，通過蜂膠總黃酮(200mg/kg)及蜂膠總黃酮(200mg/kg)聯(lián)合阿司匹林(100mg/kg)對(duì)大鼠灌胃(1次/d)，連續(xù)14d，采用熱痛法和機(jī)械壓痛法，測(cè)定各組大鼠熱痛閾潛伏期和機(jī)械壓痛閾值變化;實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與正常對(duì)照組相比，炎性痛模型組大鼠注射弗氏完全佐劑后第1天開始MWT和TWL均明顯下降，持續(xù)14d仍存在，提示炎性痛模型大鼠存在機(jī)械痛覺和熱痛覺過敏，血清中IL-6、TNF-α及NO水平明顯增高，患足關(guān)節(jié)滲出液中PLA2和PGE2水平明顯增高;同炎性痛模型組相比，炎性痛+水溶性蜂膠組、炎性痛+阿司匹林組和炎性痛+水溶性蜂膠+阿司匹林組大鼠在灌胃給藥第2天后MWT和TWL均出現(xiàn)增高，直到造模后第14天差異仍舊存在，血清中IL-6、TNF-α及NO水平明顯降低，大鼠患足關(guān)節(jié)滲出液中PLA2和PGE2水平明顯降低，差異有顯著性;大鼠足跖部和肝臟形態(tài)學(xué)檢測(cè)顯示，同炎性痛模型組相比，炎性痛+水溶性蜂膠組、炎性痛+阿司匹林組和炎性痛+水溶性蜂膠+阿司匹林組大鼠足跖部皮下組織炎性細(xì)胞浸潤明顯減少，水腫減輕;大鼠肝血竇內(nèi)炎性細(xì)胞浸潤明顯減少，肝細(xì)胞水腫明顯減輕。給各組大鼠腹腔注射用藥前，與正常對(duì)照組相比，炎性痛模型組、炎性痛+水溶性蜂膠組、炎性痛+水溶性蜂膠+納洛酮組和炎性痛+水溶性蜂膠+非選擇性一氧化氮合酶抑制劑組大鼠MWT和TWL均明顯低于正常對(duì)照組，與炎性痛模型組相比，炎性痛+水溶性蜂膠組大鼠MWT和TWL均明顯增高;腹腔注射阿片受體阻斷劑納絡(luò)酮(NAL)后，炎性痛+水溶性蜂膠+納洛酮組大鼠MWT和TWL增高程度均被部分阻斷，同炎性痛+水溶性蜂膠組相比，差異有顯著性，表明腹腔注射阿片受體阻斷劑納絡(luò)酮能部分阻斷WSP對(duì)炎性痛大鼠的鎮(zhèn)痛作用;腹腔注射非選擇性一氧化氮合酶抑制劑后，炎性痛+水溶性蜂膠+非選擇性一氧化氮合酶抑制劑組大鼠MWT和TWL均明顯高于炎性痛+水溶性蜂膠組，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05，P＜0.01)，表明腹腔注射非選擇性一氧化氮合酶抑制劑L-NAME后，通過減少炎性痛大鼠外周組織NO的生成，從而增強(qiáng)了WSP的抗炎鎮(zhèn)痛效應(yīng)?？偠灾?，實(shí)驗(yàn)結(jié)果同樣證實(shí)WSP對(duì)炎性痛大鼠有明顯的抗炎鎮(zhèn)痛作用，聯(lián)合阿司匹林后，其抗炎鎮(zhèn)痛作用明顯增強(qiáng)，其機(jī)制可能是抑制細(xì)胞因子及炎性介質(zhì)的產(chǎn)生，降低炎癥部位組織PLA2和PGE2的產(chǎn)生而實(shí)現(xiàn)的，阿片受體途徑可能也發(fā)揮一定的作用。

作者：王海華 王海珍 曾瑾 姜玉新 王靜 周萍萍 單位：皖南醫(yī)學(xué)院生理教研室