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摘要：三維細(xì)胞培養(yǎng)（Three-DimensionalCellCulture，TDCC）允許體外腫瘤細(xì)胞在各個方向上生長，可以在細(xì)胞基因表達(dá)、基質(zhì)分泌及細(xì)胞功能活動等方面更好地模擬體內(nèi)細(xì)胞狀態(tài)。TDCC既保留體內(nèi)細(xì)胞的形態(tài)，又體現(xiàn)細(xì)胞培養(yǎng)的直觀性及條件可控性，為進(jìn)一步研究腫瘤細(xì)胞特征提供了良好的平臺，特別是在轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)、藥敏研究等關(guān)鍵領(lǐng)域。TDCC將傳統(tǒng)2D細(xì)胞培養(yǎng)與動物實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ拖嘟Y(jié)合，取精用宏，為推進(jìn)腫瘤細(xì)胞生物學(xué)研究發(fā)揮舉足輕重的作用。本文著重論述TDCC技術(shù)在醫(yī)學(xué)研究中的應(yīng)用，包括腫瘤藥理學(xué)、干細(xì)胞和類器官模型的臨床應(yīng)用及生命科學(xué)研究領(lǐng)域的應(yīng)用，為臨床及基礎(chǔ)研究工作者提供理論依據(jù)與參考。

關(guān)鍵詞：三維細(xì)胞培養(yǎng)（TDCC）；藥理學(xué)；干細(xì)胞；臨床應(yīng)用；細(xì)胞外基質(zhì) 

1三維細(xì)胞培養(yǎng)的前世今生

細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)的萌芽可以追溯至1885年，德國科學(xué)家WillhelmRoux成功分離雞胚細(xì)胞并用鹽水培養(yǎng)數(shù)日[1-2]。1943年，Earle等創(chuàng)建了單層細(xì)胞培養(yǎng)法，首次創(chuàng)建長期傳代的L-細(xì)胞系，五年后，Sanford使用細(xì)胞分離培養(yǎng)法獲純L-細(xì)胞系[3]。隨著雙抗、胰蛋白酶的應(yīng)用，體外細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)日升月恒，具有易操作、成本低等優(yōu)點(diǎn)，細(xì)胞在很長一段時間內(nèi)可以無限增殖和分化，但其生長發(fā)育的環(huán)境和條件與體內(nèi)差異較大，這就導(dǎo)致細(xì)胞的基因表達(dá)和形態(tài)特征與體內(nèi)差異較大，得出的實(shí)驗(yàn)結(jié)果并不能一一在動物體內(nèi)得到重復(fù)。上世紀(jì)80年代，Weaver等對細(xì)胞與ECM間的關(guān)系進(jìn)行了系統(tǒng)性總結(jié)，在對乳腺癌細(xì)胞的研究中構(gòu)建出TDCC模型，并觀察到單層管狀腺泡樣結(jié)構(gòu)的正常乳腺上皮細(xì)胞及腺泡結(jié)構(gòu)的碗狀的癌變上皮細(xì)胞[4]，三維培養(yǎng)技術(shù)運(yùn)勢而生，正式登上歷史的舞臺，嶄露頭角。本世紀(jì)初Jacks和Weinberg[5]和Abbott[6]發(fā)表了使用MatrigelTM與海綿凝膠混合基質(zhì)進(jìn)行組織培養(yǎng)，形成了疑似三維構(gòu)造的細(xì)胞團(tuán)。同年，Amann團(tuán)隊(duì)[7]描述了使用非小細(xì)胞肺癌（NSCLC）細(xì)胞系與肺成纖維細(xì)胞組合的新型3D共培養(yǎng)模型。通過對比研究，證明了該模型更接近體內(nèi)細(xì)胞生長微環(huán)境，能更好地反映腫瘤-基質(zhì)相互作用。Young等[8]總結(jié)了前人的經(jīng)驗(yàn)，借組織輥（TRACER）平臺（生成的生物復(fù)合材料卷繞在心軸周圍以產(chǎn)生3D和分層結(jié)構(gòu)）將癌癥相關(guān)成纖維細(xì)胞（CAF）和下咽鱗狀細(xì)胞（FaDu）細(xì)胞進(jìn)行共培養(yǎng)，發(fā)現(xiàn)在培養(yǎng)物的24和48h確實(shí)產(chǎn)生了增殖速率和侵襲性細(xì)胞遷移的增加。為研究腫瘤-基質(zhì)相互作用以及新型TDCC模式提供了基礎(chǔ)。近年腫瘤基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)研究中，TDCC技術(shù)已得到越來越多的關(guān)注。

2在腫瘤藥理學(xué)研究中的應(yīng)用

Souza團(tuán)隊(duì)[9]利用2D和磁性3D生物打印系統(tǒng)培養(yǎng)并用抗腫瘤藥物紫杉醇和多西紫杉醇評估了前列腺腫瘤細(xì)胞系PC-3，LNCaP和DU145的增殖、基因表達(dá)、化學(xué)抗性和細(xì)胞毒性差異，TDCC物顯示出較低的細(xì)胞增殖率，對紫杉醇和多西紫杉醇更大的抗性以及發(fā)生了基因表達(dá)譜的改變。藥物誘導(dǎo)的肝損傷是制藥工業(yè)中與安全相關(guān)的磨損的主要原因。研究者們也在不斷突破肝細(xì)胞系和原代肝細(xì)胞這些2D肝臟模型的局限性，繼續(xù)尋找更切合體內(nèi)實(shí)際的體外模型。3D肝臟模型的出現(xiàn)，包括球狀體，3D生物打印的肝臟和肝臟上芯片，徹底改變了體外肝臟毒性測試。這些模型被統(tǒng)稱為微生理系統(tǒng)（MPS）。該模型可以在培養(yǎng)物中維持至少1個月，在此期間保持顯著的藥物代謝能力。一些MPS模型也可以與其他非實(shí)質(zhì)支持細(xì)胞共培養(yǎng)，例如內(nèi)皮細(xì)胞，庫普弗細(xì)胞和星狀細(xì)胞，這增加了毒性評估模型的多功能性。TDCC表現(xiàn)出與體內(nèi)系統(tǒng)更相似的行為，是新藥研發(fā)最有前途、更為可靠的工具。

3干細(xì)胞和類器官模型的臨床應(yīng)用

具有廣泛來源和多能分化的人多能干細(xì)胞（hPSCs）被認(rèn)為是組織修復(fù)和重建領(lǐng)域的后起之秀。然而，傳統(tǒng)的貼壁培養(yǎng)改變了hPSCs的初始生長環(huán)境，導(dǎo)致自我分化、衰退、形態(tài)學(xué)甚至基因表達(dá)等改變，三維球體培養(yǎng)在促進(jìn)hPSCs的生物活性中起著重要作用。Nachlas等[10]用透明質(zhì)酸和聚N-異丙基丙烯酰胺組成的熱響應(yīng)性3D水凝膠對hPSCs進(jìn)行培養(yǎng)，這種具有調(diào)節(jié)化學(xué)和機(jī)械性質(zhì)能力的系統(tǒng)易于在低溫下與細(xì)胞混合，在37℃時在水凝膠內(nèi)進(jìn)行物理包封，保持細(xì)胞多能性，其分化增殖能力得到加強(qiáng)。Sasagawa團(tuán)隊(duì)[11]試圖使用臍帶血衍生的內(nèi)皮祖細(xì)胞的亞型，具有強(qiáng)烈的增殖和血管生成潛力的內(nèi)皮細(xì)胞集落形成細(xì)胞（ECFC）制造血管前體，并評估這些構(gòu)建體的體內(nèi)血管生成潛力。人臍帶血管內(nèi)皮細(xì)胞（HUVEC）也用于與ECFC比較，ECFC使用纖維蛋白包被的細(xì)胞片操縱器夾在衍生的成纖維細(xì)胞（FB）片之間。將雙層FB片中插入的ECFC培養(yǎng)3d，導(dǎo)致形成與HUVEC類似的網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)。另外，當(dāng)ECFC夾在3個FB片材中時，在共培養(yǎng)后3d在3層細(xì)胞片構(gòu)建體中發(fā)現(xiàn)了管腔結(jié)構(gòu)。將含有ECFC的這些構(gòu)建體移植到免疫缺陷大鼠的皮下組織中，1周后，與HUVEC陽性移植物相同的方式觀察含有大鼠紅細(xì)胞的ECFC的功能性微血管，表明ECFC可能成為3D細(xì)胞密集組織構(gòu)建體中制造血管前結(jié)構(gòu)的替代細(xì)胞來源而在臨床得到廣泛應(yīng)用。

4生命科學(xué)研究領(lǐng)域的應(yīng)用

業(yè)已證實(shí)，3D培養(yǎng)的細(xì)胞比二維貼壁細(xì)胞具有更多的生理學(xué)相關(guān)功能。隨著腫瘤與其微環(huán)境之間相互作用的復(fù)雜性變得越來越明顯，迫切需要設(shè)計(jì)能夠真實(shí)地概括3D微環(huán)境和相關(guān)細(xì)胞群的體外模型。細(xì)胞在復(fù)雜的體內(nèi)微環(huán)境中被細(xì)胞外基質(zhì)（ECM）三維包裹，并與ECM和相鄰細(xì)胞相互作用。因此，復(fù)制ECM環(huán)境是細(xì)胞培養(yǎng)模型成功的關(guān)鍵。已有多項(xiàng)研究基于物理、化學(xué)和生物特征（例如生物相容性，生物可降解性和生物化學(xué)官能團(tuán)）使用各種天然和合成水凝膠來模擬ECM環(huán)境，由于這些特性，水凝膠可與微流控技術(shù)結(jié)合并在芯片上構(gòu)建3D系統(tǒng)，同時可控制所選水凝膠的孔隙率以促進(jìn)營養(yǎng)素和氧氣的移動，近乎完美地模擬了體內(nèi)微環(huán)境[12]。骨肉瘤（OS）是最常見的骨原發(fā)性惡性腫瘤，優(yōu)先發(fā)生肺轉(zhuǎn)移。盡管標(biāo)準(zhǔn)化療在過去幾十年中顯著改善了長期存活率，但轉(zhuǎn)移性或復(fù)發(fā)性O(shè)S患者的預(yù)后仍然非常差。因此，需要新的療法來減緩進(jìn)展并根除疾病。此外，為了更好地理解導(dǎo)致OS發(fā)作和進(jìn)展的細(xì)胞和分子機(jī)制，亟待開發(fā)類似于天然三維腫瘤微環(huán)境的新型培養(yǎng)系統(tǒng)。Angela等[13]總結(jié)了TDCC的最新技術(shù)，并報(bào)告所取得的成果，突出了這些模型在再現(xiàn)腫瘤環(huán)境中的功效，其中建立的3DOS球體模型被認(rèn)為是腫瘤研究中最具生理學(xué)相關(guān)性的三維模型[14]。然而，由于材料的選擇，制造工藝以及需要同時支持硬組織和軟組織和多種細(xì)胞群的最佳條件，使得骨腫瘤3D建模仍然是一項(xiàng)艱難的嘗試。

5結(jié)論與展望

當(dāng)下，TDCC作為一項(xiàng)新興的細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)，已從單純的懸浮成球演變到微流控、芯片、組織工程支架和3D打印培養(yǎng)，無不證明TDCC將在未來臨床醫(yī)學(xué)及基礎(chǔ)研究中起到扮演越來越重要的角色。然而，TDCC尚存一定的局限性：首先，繁瑣的制備步驟及昂貴的成本限制了其推廣；其次，有限的分化程度和生存能力阻礙了TDCC的發(fā)展。因此，我們應(yīng)積極采取措施，（1）用納米技術(shù)等更高新的材料和加工技術(shù)，讓培養(yǎng)系統(tǒng)的各項(xiàng)參數(shù)可控可調(diào)。（2）與不同類型的生物反應(yīng)器結(jié)合，如與流式生物反應(yīng)器結(jié)合，來解決三維培養(yǎng)中代謝產(chǎn)物或者藥物運(yùn)動擴(kuò)散受限的情況；（3）以此為平臺建立多種細(xì)胞共培養(yǎng)體系，如腫瘤細(xì)胞+免疫細(xì)胞+內(nèi)皮細(xì)胞共培養(yǎng)等，以明確腫瘤細(xì)胞與基質(zhì)及其他相鄰細(xì)胞之間同時作用的影響。為此，未來TDCC技術(shù)的發(fā)展需要醫(yī)學(xué)，生物科學(xué)、材料和高分子化學(xué)、物理學(xué)、儀器制造業(yè)等許多領(lǐng)域的跨學(xué)科協(xié)作發(fā)展，以上這些都將更好地模擬體內(nèi)腫瘤細(xì)胞真實(shí)的微環(huán)境情況，有助于我們得出更準(zhǔn)確的科學(xué)結(jié)論，助力精準(zhǔn)醫(yī)療。

作者：余坤 周永春 單位：昆明醫(yī)科大學(xué)第三附屬醫(yī)院