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摘要：目的分析淋巴結(jié)冰凍切片的影響因素，以提高淋巴結(jié)冰凍切片質(zhì)量。方法收集我院2016年1月~2018年12月臨床送檢的331例乳腺癌術(shù)中前哨淋巴結(jié)冰凍切片，通過對取材、包埋、制片等各個環(huán)節(jié)的分析，探討冰凍制片中出現(xiàn)的問題，總結(jié)冰凍切片的操作技巧和改良方法。結(jié)果331例前哨淋巴結(jié)冰凍活檢中，有2例出現(xiàn)假陰性，石蠟切片病理診斷發(fā)現(xiàn)微轉(zhuǎn)移灶2mm。其余冰凍切片質(zhì)量較好，組織結(jié)構(gòu)完整，細胞形態(tài)清晰，染色分明，少有冰晶形成。結(jié)論通過規(guī)范操作細節(jié)調(diào)整改進，制作高質(zhì)量冰凍切片，對診斷乳腺癌前哨淋巴結(jié)是否轉(zhuǎn)移特異性較高，是一種較為可靠而快速的診斷方法。

關(guān)鍵詞：前哨淋巴結(jié)；冰凍切片；乳腺癌；制片

前哨淋巴結(jié)（sentinellymphnode，SLN）是原發(fā)腫瘤引流區(qū)域淋巴結(jié)中的特殊淋巴結(jié)，是原發(fā)腫瘤發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移所必經(jīng)的第一批淋巴結(jié)，其組織病理學(xué)狀態(tài)可代表整個區(qū)域淋巴結(jié)的可能狀態(tài)。前哨淋巴結(jié)活檢能較準確的評估早期乳腺癌患者的腋窩淋巴結(jié)狀態(tài)[1]。前哨淋巴結(jié)的術(shù)中冰凍切片檢查是乳腺癌患者腋窩淋巴結(jié)狀態(tài)的有效且可靠的預(yù)測指標[2，3]，故前哨淋巴結(jié)術(shù)中冰凍切片準確診斷極為重要。冰凍切片檢查可以最早的了解淋巴結(jié)內(nèi)是否有轉(zhuǎn)移的腫瘤細胞，以利于確定是否需要徹底掃除腋窩淋巴結(jié)或者其它的治療措施。但冰凍切片是在低溫恒冷條件下，使組織迅速冷凍達到一定硬度制成的切片，一般要求15min內(nèi)完成，在制片工作中存在局限性，尤其淋巴結(jié)組織細胞致密，組織低溫易脆，制片存在困難，故本文將乳腺癌術(shù)中前哨淋巴結(jié)傳統(tǒng)制片方法加以探討與改進，以期不斷提高淋巴結(jié)的術(shù)中冰凍切片質(zhì)量。

1資料與方法

1.1一般資料

收集河北醫(yī)科大學(xué)附屬滄州市中心醫(yī)院2016年1月~2018年12月收治的331例臨床原發(fā)性乳腺癌女性患者的手術(shù)中切除前哨淋巴結(jié)送檢病理組織。

1.2方法

1.2.1儀器及材料采用德國產(chǎn)LeieaCM1950型恒溫冷凍切片機，OCT包埋劑，AAF固定液，蘇木素伊紅染液，梯度酒精，二甲苯。

1.2.2取材術(shù)中送檢新鮮淋巴結(jié)剔除脂肪組織，沿長軸取材，厚度0.2~0.3cm，如果淋巴結(jié)體積較小，則去除脂肪直接包埋切片。

1.2.3包埋將取材淋巴結(jié)置于-18℃冷凍切片機內(nèi)組織樣本托上，樣本托需提前放置恒溫冷凍切片機內(nèi)制冷，先加少量包埋劑打底，然后迅速放置組織，在組織周圍二次加包埋劑穩(wěn)固，待組織固定后，將冷凍錘輕壓在組織表面，使組織和周圍的支撐劑平整，冷卻后切片。

1.2.4制片淋巴結(jié)切片厚度4~5μm，將組織粘附于載玻片下2/3與下1/3交界處，取片完成后立即放入AAF混合固定液（95%乙醇85ml、40%甲醛10ml、冰醋酸5ml）中充分固定[4]。AAF混合固定液能迅速固定染色質(zhì)，且固定效果均勻，固定時間至少1.5min，固定后切片充分水洗，harris蘇木素及伊紅染色，梯度酒精脫水二甲苯透明中性樹膠封片。

1.2.5固定冰凍組織塊冰凍制片完成，再發(fā)完冰凍報告后冰凍組織塊及時取下投入固定液，繼續(xù)下一步石蠟常規(guī)脫水處理程序。

2結(jié)果

331例前哨淋巴結(jié)冰凍活檢中，有2例出現(xiàn)假陰性，石蠟切片病理診斷發(fā)現(xiàn)微轉(zhuǎn)移灶2mm。余冰凍切片平整，厚薄均勻、無皺折，鏡下淋巴結(jié)結(jié)構(gòu)完整，染色鮮明，細胞形態(tài)清晰，無腫脹及明顯收縮，無空泡及少有冰晶形成，完全滿足診斷需要（圖1），若操作不當，造成淋巴結(jié)結(jié)構(gòu)破碎，組織空洞，細胞擠壓影響閱片診斷（圖2）。

3討論

提高乳腺癌術(shù)中前哨淋巴結(jié)快速冰凍切片質(zhì)量，涉及取材、包埋、切片等各個環(huán)節(jié)。乳腺癌術(shù)中送檢前哨淋巴結(jié)往往脂肪包裹，由于脂肪組織冷凍效果差，取材盡量剔除脂肪組織，對于難以剔除脂肪組織，可以用吸水吸油擦手紙或者廚房紙輕柔按壓盡量吸去脂肪效果較好，注意動作輕柔勿壓傷細胞。之后沿長軸取材淋巴結(jié)，組織厚度≤0.3cm，注意取材過厚延長冷凍時間，容易產(chǎn)生冰晶，影響鏡下閱片診斷，傳統(tǒng)組織取材厚度≥0.5cm影響制片效果。組織包埋時，一般實驗室樣本托在常溫放置，冰凍操作過程中會延長組織與樣本托固定與冷凍時間。本研究中將樣本托提前放置于恒溫冷凍切片機中預(yù)冷，可以使組織迅速冷凍。滴加包埋劑放置組織，在組織周圍二次加包埋劑穩(wěn)固，待組織底部固定后用冷錘按壓，避免重壓組織導(dǎo)致過度變形，實驗發(fā)現(xiàn)組織取材薄平整，預(yù)冷樣本托，冷錘冷卻按壓可以加速組織冷凍。對于送檢多個淋巴結(jié)，需準備多個樣本托分別冷凍，切忌不能將送檢所有淋巴結(jié)放到一個組織樣本托制片，增加切片難度。對于個別淋巴結(jié)組織體積較小，可以由包埋劑充分包裹制片有利于切出完整帶被膜淋巴結(jié)組織，避免卷邊。另外，市售液體膠水可以替代進口包埋劑，切片效果良好，且經(jīng)濟簡便價格低廉，可以作為很好的替代品[5]。注意包埋劑用量，包裹組織但不可過量，以免延長冷凍時間。恒溫冷凍切片機一般冷凍工作室溫度控制在-24℃~-20℃，淋巴結(jié)組織冷凍后易變脆，切片易碎裂，溫度不能太低，一般在-18℃~-17℃比較合適[6]。我們將冷凍工作室溫度調(diào)至-18℃制作淋巴結(jié)冰凍切片，對于送檢部分脂肪浸潤淋巴結(jié)組織，冷凍難以制片，徠卡LeieaCM1950型恒溫冷凍切片機可以啟動單獨樣本頭速凍功能，將冷凍樣本頭溫度下降至-50℃~-35℃切片，切片完成后上調(diào)與恒溫冷凍切片機冷凍工作室溫度一致或高于冷凍工作室溫度，以保護壓縮機，提高冰凍切片機使用壽命。切片時注意動作均勻搖動把手，不可用力過猛，動作輕柔，右手拿載玻片輕輕平穩(wěn)地壓組織，使其平整地吸附在載玻片上。在貼附組織時可順著一個方向稍微用力輕輕一帶，幫助組織平展，但不可用力過猛牽拉出現(xiàn)組織變形擠壓或者空洞破碎。冰凍取片時注意一次性粘附組織片，傳統(tǒng)手法可能一張載玻片多次粘附動作，這樣雖然粘貼組織多，但前期取片組織鏡下觀察往往易發(fā)生退變，可以利用防卷板一次性多切片，然后一起粘附。對于淋巴結(jié)懷疑有轉(zhuǎn)移者，應(yīng)連續(xù)切片間隔取片3~4張，充分顯示不同層面病變做到不遺漏。如在冰凍切片中，淋巴結(jié)組織冷凍過脆出現(xiàn)破碎小裂口，或者呈粉沫狀，解決辦法是打開觀察窗戴薄膜手套用手將組織塊暖一下，或?qū)⒔M織取出來在室溫中停留片刻，令其迅速回暖再行切片，這樣就能切出完整連續(xù)的切片[7]，注意時間不可過長。切片完成后應(yīng)立即將切片放入固定液中，固定的作用是使蛋白質(zhì)變性、凝固、沉淀，保持細胞、組織原有的形態(tài)[8]，及時固定使切片細胞核結(jié)構(gòu)清晰，切忌在室溫中停留干燥再固定，否則容易造成細胞退變，喪失組織原有結(jié)構(gòu)。在室溫高或空氣干燥的情況下，室溫越高，退變速度越快[9]。固定時間要充分，至少1.5min，固定后水洗也要充分，徹底洗去多余的固定液和包埋劑，注意這兩個時間不可省略。如冰凍取片后吹風機吹干固定，梯度酒精脫水后吹干封片，都易導(dǎo)致細胞退變皺縮。冰凍制片完成，再發(fā)完冰凍報告后冰凍組織塊取出流水沖洗脫離樣本托立即投入10%中性甲醛固定液中，固定組織細胞形態(tài)結(jié)構(gòu)，避免組織自溶，保存細胞抗原性不丟失，注意不可以常溫等待自然融化。冰凍組織塊在處理完冰凍報告后常規(guī)行石蠟脫水處理程序，組織學(xué)制片石蠟病理診斷驗證術(shù)中冰凍報告。在331例前哨淋巴結(jié)冰凍活檢工作中，發(fā)現(xiàn)有2例出現(xiàn)假陰性，石蠟切片病理診斷發(fā)現(xiàn)微轉(zhuǎn)移灶2mm，冰凍制片未發(fā)現(xiàn)，考慮冰凍組織切面淺未切上，總結(jié)工作經(jīng)驗，冰凍制片還需多切面多取片。余冰凍石蠟相吻合，冰凍與石蠟診斷符合率達99.40%。綜上所述，制作高質(zhì)量冰凍切片，還需要規(guī)范操作，細節(jié)調(diào)整改進，才能不斷提高冰凍切片質(zhì)量。術(shù)中冰凍切片可以可靠地評估乳腺癌患者前哨淋巴結(jié)活檢的狀態(tài)，能夠避免大多數(shù)女性的二期手術(shù)，在早期乳腺癌患者手術(shù)中使用前哨淋巴結(jié)冷凍切片及冰凍診斷為臨床制定進一步手術(shù)方案提供了可靠依據(jù)。

參考文獻：

[1]葉春梅,高丹,黃自明,等.前哨淋巴結(jié)冰凍切片檢查在乳腺癌手術(shù)中的應(yīng)用價值[J].臨床外科雜志,2015,23(10):763-765.

[4]張偉,彭大云,周永梅,等.LeicaCM1950自動恒溫冷凍切片機在冷凍切片中的應(yīng)用[J].醫(yī)療衛(wèi)生裝備,2017,38(10):129-131.

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[6]連愛瓊.快速冰凍切片技術(shù)在病理診斷中的應(yīng)用分析[J].醫(yī)學(xué)理論與實踐,2016,29(16):2251-2252,2267.

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[8]董蕓蓉.高質(zhì)量冷凍切片的制作技術(shù)探討[J].臨床與實驗病理學(xué)雜志,2016,32(3):349-350.

[9]丁偉,王德田,董建強,等.簡明病理學(xué)技術(shù)[M].杭州:浙江科學(xué)技術(shù)出版社,2014:46-51.

作者：劉春榮 張榮菊 田亮 郭效忠 張曉玲 單位：河北醫(yī)科大學(xué)附屬滄州市中心醫(yī)院病理科